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..幽中国热带医学年第卷第期
论著
家蝇乙酰胆碱酯酶基因的克隆与序列分析
方晓东,黄俊生
摘要:目的克隆家蝇基因并进行表达,并对家蝇序列进行分析,为利用基因工程进行酶改造提供必要的
参考。方法结合已有的文献资料,利用生物信息学方法对家蝇的序列进行分析,包括密码子偏爱性、系统发
生、三维结构预测等。结果成功克隆家蝇基因,并利用同源模建方法获得了家蝇的三维结构,以果蝇
为参考,判断了家蝇应属于家族。结论根据所得家蝇的三维模型从理论上分析了因
中一个氨基酸突变导致家蝇产生有机磷抗性的可能原因,并为半理性改造家蝇乙酰胆碱酯酶提供了三维模型。
关奠词:乙酰胆碱酯酶;序列分析;进化树;三维结构;同源模建
中图分类号:. 文献标识码: 文章编号:———
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乙酰胆碱酯酶,,..是生所以在正向引物的位点的’末端加上一个以保证
物神经传导中的一种关键酶,主要存在于神经元和神经肌肉接正确的阅读框架。
头处,为膜结合蛋白,定位于细胞膜和突触前后膜,能快速正向弓物’一
水鹪神经递质乙酰胆碱,从而终止对胆反向引物’一’
碱能受体的兴奋作用,保持神经冲动传导的灵敏性。为进行酵母表达,选择和这两个表达载
乙酰胆碱酯酶可用于对部分农药进行残留速测,其操作简体,根据两者的特点,在正向克隆引物的’加上
便、易行、成本低、前期投入少,适用于有机磷与氨基甲酸酯类位点,在反向引物的’加上位点,这对引物同时
农药,根据有机磷与氨基甲酸酯类农药使昆虫中毒致死的毒力适用于和。
学原理,将乙酰胆碱酯酶与样品反应,根据乙酰胆碱酯酶活性正向引物’一
受到抑制的情况所产生的颜色变化,可判断出样品中是否含有.
超标的有机磷或氨基甲酸酯类农药。酶抑制法广泛应用对现反向引物’一℃。
场检测成效显著,成为仪器分析法的有效补充。但目前所用的用异硫氰酸弧法提取家蝇总,进行—,对得到
主要来自组织或血液提取,成本高,成分杂,影响了推广。的产物进行克隆,通过蓝白斑筛选,挑选阳性克隆进
本研究通过克隆家蝇基因,构建高效表达的工程菌, 行菌落和酶切鉴定并测序。
并通过对家蝇的一系列分析确定突变位点,再进行定点. 基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列分析一般
突变,期望能够提高重组蛋白的酶活性和稳定性。来说,在大杆菌表达系统中,如果表达序列中的含量超过
材料与方法%的时候可能会降低蛋白在大肠杆菌中的表达水平,目的蛋
. 家蝇基因的克隆根据上登录的家蝇基因白小于或者大于的蛋白都是难以表达的。另外,密
序列,并根据所要采取的表达载体的多克隆位点设计引码子偏爱性的差异也可能是能否顺利表达的一个限制因素,因
物。在正向克隆引物的’加上位点,在反向引此有必要对目的蛋白进行相关分析。
物的’加上位点,由于的阅读框架是, .. 核苷酸序列基本信息用公司的
基金项目:本项目得到国家科技部“科技基础性工作和社会公益研究专项”编号:和科技部台工作”编
号:等资助
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