cre_loxp基因敲除系统.ppt

文档介绍：基因敲除 Knock Out
背景介绍
1981 年Evans 等首次在体外分离和培养ES,成功建立了小鼠胚胎干细胞系
1985 年Smithies最早在哺乳动物细胞中发现并实现了同源重组
同源重组Homologus bination
同源重组是指发生在姐妹染色单体(sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中,需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体,将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组
同源重组示意图
同源重组示意图
一、Cre/Loxp系统
Cre重组酶(37℃)
位点特异性重组酶,介导loxp
位点间的序列同源重组
70%重组率,无需辅助因子,多种
结构的DNA底物
Loxp site
34bp反向重复序列
Flp/Frt重组系统
P1噬菌体
(1)重组方式
(2)基因敲除机理
Offspring:50% heterozygous knockout after 1 generation
基因敲除机理(续)
Offspring: 25% homozygous knockout after 2 generation
二、基因敲除的基本流程
(1)打靶载体构建
Conditional Knockout
Exon1
3N
GT/AG
Attention:
(2)转化ES细胞
电穿孔或是显微注射方法将构建好的打靶载体导入ES细胞
电转需要的细胞数量2-5x107