cre_loxp基因敲除系统.ppt

文档介绍：基因敲除 Knock Out 背景介绍 1981 年 Evans 等首次在体外分离和培养 ES ,成功建立了小鼠胚胎干细胞系 1985 年 Smithies 最早在哺乳动物细胞中发现并实现了同源重组同源重组 Homologus bination ?同源重组是指发生在姐妹染色单体( sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的 DNA 分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中,需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体,将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组同源重组示意图同源重组示意图一、 Cre/Loxp 系统? Cre 重组酶( 37 ℃) ?位点特异性重组酶,介导 loxp 位点间的序列同源重组? 70% 重组率,无需辅助因子,多种结构的 DNA 底物? Loxp site ? 34bp 反向重复序列? Flp/Frt 重组系统 P1 噬菌体(1)重组方式(2)基因敲除机理 Offspring : 50% heterozygous knockout after 1 generation 基因敲除机理(续) Offspring: 25% homozygous knockout after 2 generation 二、基因敲除的基本流程(1)打靶载体构建 Conditional Knockout Exon1 3N GT/AG Attention: (2)转化 ES细胞电穿孔或是显微注射方法将构建好的打靶载体导入 ES 细胞电转需要的细胞数量 2-5x107