文档介绍：WB注意事项及常见问题注意事项一、样本收集组织样本原则上要求客户或我们的技术员把组织分切剪碎至研磨管 (根据实验的需要告知他们取多少组织),并加入适量裂解液和研磨珠,然后放置于 -80℃保存。具体详情参照“”;细胞样品原则上要求客户或我们的技术员不要用胰酶把细胞消化下来, 特别是分选对象是膜蛋白时,具体详情参照 “细胞样品收集注意事项 .doc”;二、总蛋白提取组织样品具体详情参照“”;记得加入蛋白酶抑制剂,如果分选对象是磷酸化蛋白时,记得加入磷酸化酶抑制剂;细胞样品具体详情参照“细胞样品收集注意事项 .doc”;记得加入蛋白酶抑制剂,如果分选对象是磷酸化蛋白时,记得加入磷酸化酶抑制剂;三、蛋白样本保存裂解细胞或组织提取总蛋白时,细胞碎片沉淀一般 -20℃保存以防万一,提取好的蛋白样品分装 2份,一份加入上样缓冲液变性后 -20℃保存,一份直接-20℃保存;四、蛋白变性提取好的总蛋白取一部分(不是全部)加入上样缓冲液进行加热变性( 100℃,5min),变性好的蛋白应该-20℃保存,冻融后不再需要加热变性;五、 SDS-PAGE1. 浓缩胶的胶浓度一般为 5%,用于压沉样品;分离胶的胶浓度取决于分析对象的分子量大小,;分离胶和浓缩胶的高度比为8:3;电泳结束后,应及时用清洗干净玻璃板,清洗时应使用海绵擦布,切勿使用刷子,以免刮花玻璃板;电泳结束后,应及时冲洗电泳槽,以免盐离子沉积,导致电泳丝腐蚀;清洗电泳芯时,一定要注意别弄段电泳丝;六、转膜注意海绵垫,滤纸(转膜专用滤纸),转印膜,胶的叠放位置,以保证正确的转印方向;注意海绵垫,滤纸(转膜专用滤纸),转印膜,胶的相对大小,以免造成短路;3. 转印结束后,应及时取出转印膜,并立即用 TBST漂洗1-2遍,并立即加入封闭液,这样可以避免膜上的杂质残留或膜变干导致背景高的问题;转印结束后,应及时冲洗转印槽和转印芯,以免盐离子沉积,导致电泳丝腐蚀;转印结束后,应及时用水泡洗海绵垫和滤纸,以免盐离子沉积,导致转膜时短路,并放在篮子上晾干,如果海绵垫和滤纸不及时晾干,容易导致海绵垫和滤纸内部的结构破坏;七、封闭进行封闭时,应加入足量的封闭液(以完全覆盖膜为底限),并保证整个封闭过程中,膜与封闭液充分接触,避免长时间离开封闭液,特别进行4℃静止封闭过夜时,一定要加入足量的封闭液和保证平坦放置;上述注意事项主要为了避免膜变干,导致背景升高;八、一抗杂交一抗的稀释比例:第一次使用时参考具体抗体说明书建议的稀释比例,并根据实际的实验结果进行调整;杂交条件:如果是室温孵育,至少保证孵育1-2小时,并放置脱色摇床上进行摇晃,如果是4℃孵育,应孵育过夜,可静止亦可放置脱色摇床上进行摇晃;3. 应使用专用的一抗稀释液进行稀释,使用后进行回收并 4℃保存,如果回收的稀释抗体用沉淀或长菌,应丢弃;九、一抗杂交后洗膜一般使用标准的TBST缓冲液,如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高,可以把NaCl的浓度提高到500nM(标准的为150nM);一般洗涤3次,每次10min,如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高,可以把洗涤次数提高到4-6次;十、二抗杂交二抗的稀释比例:第一次使用时参考具体抗体说明书建议的