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WB注意事项及常有问题
注意事项
一、样本收集
组织样本
原则上要求客户或我们的技术员把组织分切剪碎至研磨管（根据实验的需要告
知他们取多少组织），并加入适量裂解液和研磨珠，然后放置于 -80℃保存。详尽
详情参照“”；
细胞样品
原则上要求客户或我们的技术员不要用胰酶把细胞消化下来，特别是分选对象是
膜蛋白时，详尽详情参照 “细胞样品收集注意事项 .doc”；
二、总蛋白提取
组织样品
详尽详情参照“”；记得加入蛋白酶抑制剂，如果分选
对象是磷酸化蛋白时，记得加入磷酸化酶抑制剂；
细胞样品
详尽详情参照“细胞样品收集注意事项 .doc”；记得加入蛋白酶抑制剂，如果分选
对象是磷酸化蛋白时，记得加入磷酸化酶抑制剂；
三、蛋白样本保存
裂解细胞或组织提取总蛋白时，细胞碎片积淀一般 -20℃保存以防万一，提取
好的蛋白样品分装 2份，一份加入上样缓冲液变性后 -20℃保存，一份直接-20℃
保存；
四、蛋白变性
提取好的总蛋白取一部分（不是全部）加入上样缓冲液进行加热变性（ 100℃，
5min），变性好的蛋白应该-20℃保存，冻融后不再需要加热变性；
五、 SDS-PAGE
1. 浓缩胶的胶浓度一般为 5%，用于压沉样品；
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分别胶的胶浓度取决于解析对象的分子量大小，；
分别胶和浓缩胶的高度比为8:3；
电泳结束后，应实时用冲刷洁净玻璃板，冲刷时应使用海绵擦布，切勿使用刷子，省得刮花玻璃板；
电泳结束后，应实时冲刷电泳槽，省得盐离子沉积，致使电泳丝腐化；
冲刷电泳芯时，一定要注意别弄段电泳丝；
六、转膜
注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸），转印膜，胶的叠放位置，以保证正确的转印方向；
注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸），转印膜，胶的相对大小，省得造成短路；
3. 转印结束后，应实时取出转印膜，并立刻用 TBST漂洗1-2遍，并立刻加入
封闭液，这样可以防备膜上的杂质残留或膜变干致使背景高的问题；
转印结束后，应实时冲刷转印槽和转印芯，省得盐离子沉积，致使电泳丝腐化；
转印结束后，应实时用水泡洗海绵垫和滤纸，省得盐离子沉积，致使转膜时短路，并放在篮子上晾干，如果海绵垫和滤纸不实时晾干，容易致使海绵垫和滤纸内部的结构破坏；
七、封闭
进行封闭时，应加入足量的封闭液（以完全覆盖膜为底限），并保证整个封闭
过程中，膜与封闭液充分接触，防备长时间分开封闭液，特别进行4℃静止封闭过夜时，一定要加入足量的封闭液和保证平坦放置；上述注意事项主要为了防备膜变干，致使背景升高；
八、一抗杂交
一抗的稀释比率：第一次使用时参照详尽抗体说明书建议的稀释比率，并根据实际的实验结果进行调整；
杂交条件：如果是室温孵育，最少保证孵育1-2小时，并放置脱色摇床上进行摇晃，如果是4℃孵育，应孵育过夜，可静止亦可放置脱色摇床上进行摇
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晃；
3. 应