两种大肠杆菌表达融合蛋白的纯化.doc

文档介绍：两种大肠杆菌表达融合蛋白的纯化
作者:王飙落陈南春陈苏民
【关键词】融合蛋白
关键词: 融合蛋白;纯化

0 引言
,重组蛋白在大肠杆菌中往往形成不溶解的无活性的包涵体,,对如何获得有活性的蛋白表达产物进行初步的探讨.

1 材料和方法

材料融合表达质粒pJLcII ras和pGEX-4T-,Sepharose4B层析柱和其他生化制剂均由本校生化教研室提供.

方法将质粒pJLcII ras,pGEX-4T-mcp分别转化感受态TAP106,JM109,,分别行37℃水浴和IPTG诱导表达,集菌并裂菌后120g・L-1 SDS-PAGE分别鉴定菌体、裂菌后上清及沉淀中融合蛋白p21ras 和GST-MCP-1表达情况[1] .诱导扩增后的菌液离心收集菌体,裂菌,Triton X100等去垢剂反复洗涤,最终离心后沉淀用8mol・L-1 溶液分别针对4,2,1,,,,Sepharose4B凝胶柱平衡液进行缓慢梯度透析,-MCP-1则针对GST亲和层析柱平衡液透析,离心后行GST亲和柱层析,产物经48孔微型趋化装置测定其趋化活性[2] .


2 结果
℃诱导后,120g・L-1 SDS-PAGE检测可见在约23ku处出现一条新生条带(图1).%.转化后的JM109菌IPTG诱导后可见于30ku处出现一新生条带(图2).%.两新生条带分别符合融合蛋白p21cII ras和GST-MCP- X100等溶液反复洗涤后, ras经梯度透析后过柱纯化,-MCP-1溶液经平衡透析后则直接行亲和层析,终产物有明确的单核细胞趋化活性.
图1 略

图2 略

3 讨论
在原核生物尤其是大肠杆菌中表达外源基因产物时,,并且缺乏一些在肽链形成过程中必要的诱导分子,所以常常在胞质中形成难以溶解的无活性的包涵体[3,4] .

我们实验中所见两种融合蛋白均主要以包涵体形式存在,虽然为初步的纯化提供了有利条件,,没有足够的时间和空间进行折叠和盘曲等空间构象的形成[5] ,本实验采取了先用变性剂溶解包涵体,再通过缓慢的梯度透析逐渐除去变性剂,在这一过程中相当一部分肽链得以恢复其天然构象,成为可溶状态,经柱层析纯化后证实产物具有