文档介绍：周坤福
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核酸分子杂交(nucleic acid molecular hybridization)
是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。
杂交双方分别称为探针与待测核酸。
杂交分子:杂交后形成的异源双链分子
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核酸分子杂交技术
是指用标记的已知DNA或RNA片段检测样品中未知核酸序列,通过碱基互补配对原则发生同源性结合,再经显影或显色的方法,将结合的核酸序列的位置或大小显示出来。
是目前生命科学研究领域中应用最广泛的技术之一,是定性或定量检测DNA或RNA序列片段的有力工具。
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核酸探针( probe ):带有可检测标记的已知序列的互补DNA或RNA片段。通常用核素或非核素示踪标记。
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第一节核酸分子杂交的基本原理
第二节核酸探针
第三节核酸分子杂交技术
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第一节核酸分子杂交的基本原理
具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下(适宜的温度及离子强度等)碱基互补配对结合,重新形成双链;在这过程中,核酸分子经历了变性和复性的变化,以及复性过程中各分子间键的形成和断裂等。
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一、变性(denaturation)
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加热、酸、碱、某些理化试剂(如尿素、甲酰胺)
增色效应(hyperchronic effect):核酸变性时,紫外吸收值A260随之升高的现象。
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在某些理化因素的作用下,核酸双链分子碱基对的氢键断裂,疏水作用被破坏,有规则的结构被破坏,双股螺旋(NDA)或发夹结构(RNA)打开,形成单链分子。
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变性的因素
除物理、化学因素外,DNA分子的组成也影响变性。最主要的是DNA分子中GC的含量,GC含量高的DNA不易变性,而AT含量高的DNA容易变性。
另外环状DNA比线性DNA难于变性。
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(1)热变性
DNA的熔解曲线
Tm值(melting temperature):热变性时,50%DNA分子变性的温度。又叫解链温度、熔解温度。
Tm=(G+C)%×+
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热变性
当温度<70℃,DNA几乎不变性;
当温度介于70~90℃时,DNA部分变性;
当温度>90℃,DNA完全变性;
当温度>100℃,DNA双链分离;
通常核酸的变性温度可选在90~100℃之间。
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