文档介绍：His标签单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:王文礼, 王云龙, 李晨阳, 陈小科, 刘利锋
【摘要】目的: 制备和鉴定抗His标签单克隆抗体(mAb), 初步建立检测和纯化带His标签融合蛋白的方法。方法: 用碳化二亚胺法合成His-tag完全抗原, 免疫BALB/c小鼠, 采用杂交瘤技术进行细胞融合, 通过有限稀释法和间接ELISA法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株。常规制备腹水, 用辛酸-硫酸铵法纯化, 并对纯化的mAb进行特异性鉴定。结果: His-tag完全抗原偶联成功, 经细胞融合、筛选及克隆化, 成功获得1株分泌His标签mAb的杂交瘤细胞株。制备腹水测得腹水效价高于 1∶106, 且此株mAb与其他融合蛋白标签无交叉反应, 并在含His标签融合蛋白的鉴定实验中取得了满意效果。结论: 成功制备了1株His标签mAb, 为带His标签融合蛋白的研究应用提供了重要的工具。
【关键词】 His标签单克隆抗体蛋白印迹
His-tag是由6个组氨酸(His-His-His-His-His-His)组成的短肽,专门设计用于重组蛋白质的吸附纯化, His-tag 融合标签与其他标签相比有很多明显优势, 是目前用于纯化的融合标签中使用最为广泛的一种[1]。利用 His标签可以建立一个基于融合蛋白的高效检测和纯化系统。目前商品化His-tag的单克隆抗体(mAb)种类不多, 且价格也十分昂贵。因此, 研制出 His-tag的mAb, 在融合蛋白质的研究中具有非常广泛的应用前景。
1 材料和方法
材料 His六肽为西安蓝晶生物科技有限公司合成; 卵清白蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)、兔抗小鼠 IgA、 IgG1、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3和IgM抗体均购自Sigma公司; HRP标记的羊抗鼠 IgG由河南省生物工程技术研究中心提供; MULTISKAN MK3酶标仪购自Thermo公司; 3326型CO2培养箱购自Forma公司; 硝酸纤维素膜(NC膜)购自Amersham公司; SDS-PAGE电泳仪购自BIO-RAD公司; BALB/c纯系雄性小鼠(鼠龄6~8周, 体质量18~22 g)购自中国医学科学院动物研究所。
方法
人工抗原的合成(1)免疫原的合成: mg His-tag和5 mg OVA溶于1 mL PB( mol/L, )中, 充分溶解后, 将200 mg EDC的PB溶液逐滴加入, 边滴入边混匀, 摇床100 r/min反应4 h, 4℃静置过夜, 用 mol/L, PBS透析 72 h, 存储于-20℃备用。(2)包被抗原的合成: 合成方法同免疫抗原的合成,载体蛋白为 BSA。
杂交瘤细胞株的建立按本室常规方法免疫BALB/c小鼠(20~30 μg /只), 末次免疫后免疫小鼠血清效价达到 1∶10 000以上, 进行细胞融合, 并以间接ELISA法筛选分泌抗 His-tag的阳性克隆。克隆化及腹水制备, 均按实验室常规方法进行。
mAb特性鉴定(1)效价测定: 以 BS