文档介绍：抗PTDbcr/abl单克隆抗体的制备及鉴定
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
【摘要】目的: 制备单克隆抗体(mAb)并初步用于PTDbcr/abl融合蛋白的研究, 为慢性粒细胞白血病的免疫治疗提供实验依据。方法: 在大肠杆菌中表达PTDbcr/abl融合蛋白, 用所获得的蛋白免疫BALB/c小鼠, 常规收集小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合, 筛选杂交瘤细胞株的阳性克隆, 并对其进行一系列鉴定。结果: (1)表达PTDbcr/abl融合蛋白; (2)制备了抗PTDbcr/abl融合蛋白mAb; (3)用mAb以多种方法检测PTDbcr/abl融合蛋白, 证实此抗体效价高, 特异性强。结论: 此抗体可用于PTDbcr/abl融合蛋白的进一步研究。
【关键词】 PTDbcr abl融合蛋白单克隆抗体制备
PTDbcr/abl是一种利用基因工程合成的融合蛋白[1, 2]。其中PTD(蛋白转导结构域)是人类免疫缺陷病毒(HIV)1所编码的反式激活蛋白TAT的一段多肽片段, 具有独特的跨膜转运方式, 其特点是转导速度快, 效率高。Schwarze等[3]发现将PTD融合于相对分子质量(Mr)为15
×103~2×105的蛋白时, 可介导这些蛋白从细胞外向细胞内直接跨膜转运。Bcr/Abl是慢性粒细胞白血病(CML)细胞中特异的bcr/abl融合基因所编码的融合蛋白, 其Mr为21×104, 具有异常的酪氨酸激酶活性。我们以前已利用基因重组方法构建了PTDbcr/abl的原核表达质粒, 并在大肠杆菌中获得表达。而且证实表达产物PTDbcr/abl融合蛋白与K562或HL60细胞共同孵育后, 可进入细胞内[1]。我们用纯化的PTDbcr/abl融合蛋白抗原免疫BALB/c小鼠, 常规收集小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合, 筛选杂交瘤细胞株的阳性克隆。经ELISA、 Western blot及免
疫组化方法检验, 证实mAb特异性强, 效价高, 可用于PTDcr/abl融合蛋白的进一步研究。
1 材料和方法
材料
大肠杆菌BL21购自Navagene公司。表达PTDbcr/abl融合蛋白的质粒pET16bPTDbcr/abl、 HL60、 K562细胞株由本室构建保存; BALB/c小鼠由第四军医大学实验动物中心提供; 免疫组化试剂盒(链亲和素抗生物素蛋白过氧化酶免疫组化超敏试剂盒)购自迈新公司; 小鼠IgG亚类快速定性试纸购于法山羊抗小鼠IgG抗体(由华美生物提供); 免疫球蛋白标准亚类试剂购自Sigma公司。
方法
PTD
bcr/abl融合蛋白的表达与纯化
质粒pET16bPTD与质粒pET16bPTDbcr/abl的制备按照文献[1]进行。用pET16bPTDbcr/abl转化大肠杆菌BL21, 取阳性克隆培养扩增, 用IPTG进行诱导表达后收集菌体, PBS悬浮, 超声裂菌, 并用8 mol/L脲溶解蛋白, 用8mol/L脲(、、、 )在NiNTAagarose柱上对蛋白进行亲和层析。