文档介绍：广州医学院
硕士学位论文
肿瘤源性早孕因子单克隆抗体制备及鉴定
姓名:吴晓亮
申请学位级别:硕士
专业:卫生毒理学
指导教师:王家骥
2011-05
广州医学院硕士学位论文肿瘤源性早孕因子单克隆抗体制备及鉴定
肿瘤源性早孕因子单克隆抗体制备及鉴定

硕士研究生:吴晓亮
导师:王家骥教授
中文摘要
目的:应用基因工程技术制备肿瘤源性重组 EPF,将其与弗氏佐剂混合后对
BALB/c 小鼠进行免疫,并以较为成熟的单克隆抗体杂交瘤技术,建立分泌抗 EPF
单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备 EPF 单克隆抗体,为进一步探索以 EPF 单克
隆抗体为基础的酶联免疫吸附测定(ELISA)等方法进行超早孕及某些恶性肿瘤
等的早期诊断奠定基础。方法:从黑色素瘤标本中提取总 RNA,RT-PCR 扩增
EPF 基因,将扩增产物和载体 pGEX-5X-1 进行双酶切后回收,连接载体和目的
片段,获得重组质粒,将重组质粒转化大肠杆菌 BL21。在大肠杆菌 BL21 中通
过 IPTG 进行诱导表达,然后用谷胱甘肽-琼脂糖球珠亲和层析纯化,经 Xa 酶切
得到纯的 EPF 蛋白。用 SDS-PAGE 鉴定其纯度,用玫瑰花环抑制试验(RIT)检
测其生物学活性。将制备的重组肿瘤源性 EPF 蛋白作为抗原免疫 BALB/c 小鼠,
用免疫后的小鼠脾细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞(NS-1)融合,并通过间接 ELISA
方法筛选克隆阳性杂交瘤细胞株,经克隆化,获得可稳定分泌抗 EPF 单克隆抗
体的细胞株。注入 BALB/c 小鼠腹腔制备腹水型单克隆抗体,经 Protein-G 亲和
层析纯化,SDS-PAGE 和 Western-blot 等方法鉴定 EPF 单克隆抗体。结果:制备
的重组 EPF 纯度较好,具有良好的免疫原性。融合后经克隆化获得五株稳定分
泌抗 EPF 抗体的细胞株,将细胞注射入 BALB/c 小鼠腹腔获得腹水型单克隆抗
体,以亲和层析法纯化,SDS-PAGE 分析显示纯化后去掉大部分杂蛋白,抗体纯
度较高,Western-blot 分析显示抗体与抗原匹配性良好。结论:制备的重组 EPF
蛋白纯度高且具有良好的免疫原性。获得五株稳定分泌抗 EPF 抗体的杂交瘤细
胞株。制备的 EPF 单克隆抗体纯度好,与抗原匹配性良好。

关键词:早孕因子;重组;单克隆抗体;酶联免疫吸附测定

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广州医学院硕士学位论文肿瘤源性早孕因子单克隆抗体制备及鉴定
Preparation and Characterization of Monoclonal Antibodies
against Tumor-derived Early Pregnancy Factor
Postgraduate: Wu Xiao-liang
Supervisor: Wang Jia-ji
Abstract
Objective: Applying ic engineering to prepare tumor-derived binant
EPF, BALB/c mice were immunized by Freund’s adjuvant immunization method. The
hybridoma cell lines that secreted anti-EPF monoclonal antibodies (McAb) with high
affinity were established by hybridoma technique. Preparation of McAb is useful for
further study by using the EPF monoclonal antibody-based enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) and other methods to diagnosis ultra-early pregnancy
and malignant tumors. Methods: The total RNA was extracted from Melanoma. EPF
gene fragment was amplified with RT-PCR, cloned into the expression vector
pGEX-5X-1. The binant plasmid pGEX-5X-1/EPF was constructed in this way
and expresse