文档介绍：NOX4报告基因重组质粒的构建及表达调控初探
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:赵丽君刘燕翔刘珍王伯瑶黄宁吴琦
【摘要】目的:构建NOX4荧光素酶报告基因质粒载体,探讨NOX4基因表达调控机制。方法:以细胞基因组DNA为模板作,采用PCR扩增NOX4基因上游调控序列(533bp),插入质粒pGL3basic载体,构建重组质粒pGL3NOX4,重组质粒经酶切和测序鉴定。将pGL3NOX4转染A549细胞,通过细胞因子刺激观察报告基因表达水平。结果:酶切及测序证实NOX4报告基因质粒构建成功。转染报告基因的A549细胞以细胞因子刺激,结果显示NOX4表达增强。结论:成功构建了NOX4荧光素酶报告基因质粒载体,为进一步研究NOX4基因的表达规律及生理功能奠定了基础。
【关键词】 NOX4;报告基因;表达调控
还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶首先发现于中性粒细胞和单核/巨噬细胞,在吞噬微生物病原体时,NADPH氧化酶被激活,细胞发生呼吸爆发,产生大量活性氧簇(reactive oxygen species,ROS),成为机体抵抗微生物感染的重要成分[1]。近年,在非吞噬细胞质膜上发现了NADPH氧化酶的同源物家族,被命名为NOX(NADPH oxidase)蛋白家族。人类基因组同源性检索发现了7种NADPH氧化酶,即NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、Duox1和Duox2[2-4]。。NOX家族广泛表达于机体的组织器官,它们的生物学功能成为当前研究的热点领域。为了探讨NOX家族中NOX4在机体炎症和免疫反应中的作用,我们构建NOX4报告基因重组质粒pGL3
NOX4,并初步观察了炎症细胞因子对该基因表达水平的影响。
1 主要材料和试剂
A549上皮细胞株、 DH5α为本实验室保存。荧光素酶报告基因载体pGL3basic,海肾荧光素酶内对照报告载体pRLTK及DualLuciferase Report Assay System为Promega产品。质粒提取,PCR产物纯化及凝胶回收试剂盒购自Omega公司。DMEM培养基、转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。新生小牛血清购自兰州民海生物工程有限公司,细胞因子TNFα、IFNγ购自PeproTech公司。Pfu酶,dNTP,限制性内切酶(Xho1,BamHⅠ),T4DNA连接酶等购自Takara公司。基因组DNA提取试剂盒,DL2000 DNA Marker购自天根生物技术有限公司。
2 方法
质粒载体的构建
引物合成通过GenBank检索NOX4基因全序列,参考相关文献,设计扩增出含有NFκB结合位点的NOX4基因上游调控序列。,其序列如下:
TCTCGAGGAG
ACTTTTAGTATGAG
P2:AGGCAGAGGTGTTTA
引物分别含限制性内切酶Xho1,BamHⅠ酶切位点,扩增片段全长533bp。引物由大连宝生物技术有限公司合成。
PCR 以细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增。反应体系为25μL,含10×PCR反应bu