文档介绍：pEGFPC2GATA4真核表达载体的构建及在P19细胞中的表达
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:张金平,王巍,张雷,王慧娟,赵春芳,陈炜,赵秀军
【摘要】目的: 构建小鼠GATA4基因融合绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFPC2GATA4,并检验其在P19细胞中的瞬时表达. 方法: 以真核表达质粒pEFSAGATA4为模板,PCR扩增得到小鼠GATA4基因片段,将目的片段亚克隆到pEGFPC2载体,卡那霉素筛选阳性克隆,经菌落PCR、酶切鉴定和测序鉴定. 将重组质粒pEGFPC2GATA4以脂质体法瞬时转染P19细胞,用免疫细胞化学、共聚焦扫描显微镜、PCR、免疫印记法检测GATA4在P19细胞中的表达. 结果: 酶切、测序结果表明将基因片段GATA4正确插入pEGFPC2载体,并可在P19细胞中检测到GATA4基因和GATA4EGFP融合蛋白表达. 结论: 成功构建真核表达质粒pEGFPC2GATA4,并在P19细胞瞬时表达成功,为进一步研究GATA4在心脏发育中的作用奠定了基础.
【关键词】 pEGFP
C2载体;GATA4;真核表达质粒;P19细胞;转染
0引言
GATA4是GATA锌指转录因子家族中的一员,具有结合核酸共同序列GATA的特性,是目前研究最多的与心脏发育密切相关的转录调控因子之一[1]. GATA4作为心脏前体细胞的最早标志之一,在调节心肌细胞的发生、分化以及心肌前体细胞形成线状心管等过程中发挥重要作用[2]. 为进一步研究转录因子GATA4在心脏发育及心肌分化中的作用,本研究构建了含有小鼠GATA4编码框的pEGFPC2GATA4真核表达载体,并在P19细胞中瞬时表达成功,为进一步研究心脏特异转录因子的功能及调控机制奠定了基础.
1材料和方法
, XbaI和HindⅢ购自TaKaRa,转染试剂Lipofectamine2000和培养基αMEM购自invitrogen公司,DNA回收试剂盒、T4 DNA连接酶、DNA marker购自宝生物公司,PCR试剂盒购自赛百盛公司,质粒抽提试剂盒购自Promega公司,pEFSAGATA4质粒由日本Hiroshi AKAZAWA博士惠赠,pEGFPC2载体、感受态菌株DH5α由本实验室保存. P19细胞系来源于中国武汉细胞库. 胎牛血清、胰蛋白酶、青链霉素、SP免疫组化即用型试剂盒、兔GATA4一抗(Santa公司)均购于博海生物公司.

GATA4质粒为模板,上游引物:5′ATGGC 3′,引入酶切位点EcoRI;下游引物:5′ATGA 3′,引入酶切位点XbaI. 反应体系如下:10×Buffer(含MgCl2) μL,5 mmol/L dNTP 2 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,质粒模板DNA μL,5 U/μL Ex μL,补水至25 μL,瞬时离心混匀,循环参数:95℃ 5 min,95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 80 s,25个循环;72℃ 10 min. 反应完毕后,琼脂糖凝