文档介绍：ROCKⅡ基因shRNA质粒表达载体的构建与鉴定
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作者:李晓江白云深杨有庚
【摘要】目的构建表达Rho激酶(ROCK)Ⅱ特异性siRNA的重组质粒。方法按照Elbashir等设计原则和siRNA表达载体的要求,利用Ambion公司在线siRNA Tatget finder软件,设计带有BamH I、Bbs I酶切黏性末端、终止识别序列和LOOP环的shRNA,并将其克隆入载体pGPU6/GFP/Neo,构建成ROCKⅡ特异siRNA重组质粒,然后进行酶切鉴定及基因测序。结果设计的shRNA成功克隆入载体pGPU6/GFP/Neo,构建成ROCKⅡ特异siRNA重组质粒,酶切鉴定及基因测序表明设计序列完全相符,目的基因序列准确无误。结论重组质粒构建成功,为今后体外或体内研究ROCK基因在脊髓损伤后的功能修复提供了一种有效的方法。
【关键词】载体构建;RNA干扰;ROCK(Rho激酶)
RNA干扰(RNAi)是由双链RNA介导的、在转录后mRNA水平关闭相应基因表达的过程。将与靶基因转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(dsRNA)导入细胞后,生成的小干扰RNA(siRNA)与RNAi特异性酶结合,形成RNA诱导的沉默复合物,具有序列特异性核酸内切酶活性,能特异性降解该mRNA,从而产生相应的功能表型缺失。本研究采用含H1启动子的载体pGPU6/GFP/Neo,针对ras基因超家族中Rho激酶(ROCK)基因的短发夹结构RNA(shRNA)构建靶向ROCK
Ⅱ特异性shRNA真核表达载体,为今后体外或体内研究ROCK基因在脊髓损伤后的功能修复提供一种有效方法。
1 材料与方法
材料、试剂与仪器生化培养箱、震荡培养箱(金坛仪器厂),荧光显微镜(OLYMPUS公司)。连接试剂盒、小量抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒(QIAGEN公司),限制性内切酶(TaKaRa公司)。
shRNA序列设计及合成根据pGPU6/GFP/Neo中H1启动子启动表达siRNA对序列的要求,利用Ambion公司在线siRNA Tatget finder软件、.设计合成4条针对大鼠ROCK序列的siRNA DNA片段,分析获得的序列,选择GC含量在40% ~55% 之间的靶基因序列作为潜在优选,并在GenBank表达序列标签(EST)数据库中用BLAST检索,将选定的序列和相应的基因组数据库进行比较,排除和其他编码序列同源的序列,以确定其为特异性序列。为了提高序列正确退火成为双链DNA分子的效率,将包含目的siRNA序列的DNA设计为用DNA聚合酶合成的(PCR策略分别设计)包含目的基因siRNA序列的正义链和反义链寡核苷酸序列,在正义链和反义链序列加入间隔序列TTCAAGAGA,以避免形成终止信号,使其能形成发夹结构,shRNA的转录终止序列采用T6结构。正义链模板的5′,与Bbs I酶切后形成的黏端互补;反义链模板的5
′端添加了GATC,与BamH I酶切后形成的黏端互补;如果siRNA的第1个碱基不是G,后补加1个G。随机选取排列序列作为无干扰效果对照序列。编码siRNA的DNA序列由上海生工合成。4条寡核苷酸链及反义链见表1