文档介绍：人Tum5基因逆转录病毒载体及包装细胞株的构建
作者:盖晓东罗宏历春冯凯
【摘要】目的构建携带Tum5基因的逆转录病毒载体并对其进行包装,获得稳定的产毒细胞系。方法采用RTPCR法从胎肾组织中扩增Tum5基因片断,并将其定向克隆到逆转录病毒载体pLXSN中进行PCR、双酶切和测序鉴定。利用电穿孔方法将获得的重组质粒转染PA317细胞,经G418 筛选抗性克隆,收集病毒上清后感染NIH3T3 细胞测定病毒滴度。结果 PCR、酶切证实Tum5基因克隆至逆转录病毒载体pLXSN,Tum5基因测序结果和原始序列相同。重组逆转录病毒载体转染PA317 包装细胞,RTPCR证实转染后的PA317细胞上清液中存在携带人Tum5基因的病毒RNA,×104cfu/ml。结论成功的构建了携带人Tum5基因的逆转录病毒载体,获得了稳定的产毒细胞系。
【关键词】 Tum5基因;pLXSN;基因治疗;抗血管生成;逆转录病毒载体
肿瘤的生长转移依赖于血管生成,抑制肿瘤血管的生成成为肿瘤治疗学研究的新热点。肿瘤抑素(tumstatin)是最新发现的肿瘤血管生成抑制因子,可有效抑制人内皮细胞的增生,引起内皮细胞凋亡,抑制新生血管的生成,达到抗肿瘤生长的目的〔1〕。Tum5是肿瘤抑素的抗血管生成活性片段,并与全长肿瘤抑素具有相同的抗血管活性〔2〕。其抗血管生成作用要比先前发现的血管内皮抑素(endostatin)强10倍,并呈剂量依赖关系〔3〕。本研究立足于抗血管生成的基因治疗原理,构建携带Tum
5基因的逆转录病毒载体并对其进行包装,以获得稳定的产毒细胞系,使得Tum5用于肿瘤以及其他血管依赖性疾病的基因治疗成为可能。
1 材料与方法
材料 pLXSN 质粒由扬州大学馈赠,大肠杆菌菌株DH5α为北华大学生命科学中心保存,胎肾组织来自吉林市妇产医院,Trizol和G418均购自GIBICO公司,RTPCR试剂盒、DNA纯化试剂盒、各种工具酶及Marker等均购自大连TaKaRa公司,PA317细胞购自中科院上海细胞研究所,NIH3T3细胞由东北师范大学生科院馈赠。DMEM培养基、新生牛血清购自长春市博德生物公司。其余试剂均为国产分析纯。pany生产的Multiporator型细胞融合仪。Tum5引物序列由上海生工生物技术有限公司合成,P1:5′ACGGAC3′(划线部分为EcoRⅠ酶切位点);P2:5′3′(划线部分为BamHⅠ酶切位点)。
方法
RTPCR方法扩增目的基因片段从液氮罐中取出冻存的胎肾组织块放入研钵中,少量多次加入液氮,研成极细粉末。将粉末移至离心管中,用Trizol 裂解液提取总RNA 。然后以2 μg 的总RNA 为模板,以Oligo(dt)15为引物进行反转录,制备cDNA。以TaqDNA聚合酶进行PCR 扩增,反应条件:94℃预变性4 min,94 ℃变性1 min,54 ℃退火1 min,72℃延伸1 min,共30个循环。末次循环后再于72 ℃继续延伸10 min。将得到的基因片段进行琼脂糖电泳分析,最后用PCR纯化试剂盒纯化和回收所需要的目的基因片段。
重组体pLXSNTum5的构建与鉴定将Tum5基因片段与已进行