文档介绍：逆转录病毒载体介导HSV1
作者:杜标炎, 谭宇蕙, 吴映雅, 赵鹏, 周联, 赵亚刚
【关键词】自杀基因
摘要:【目的】探讨自杀基因抗肿瘤系统构建的方法。【方法】用DNA重组技术将单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV1tk)定向克隆入逆转录病毒载体pLXSN,并用限制性内切酶进行酶切及测序鉴定;用PolyFect Transfection试剂介导重组逆转录病毒转染入包装细胞系PT67,通过G418筛选建立稳定产病毒的细胞株,将病毒感染人胃癌细胞,检测HSV1tk自杀基因治疗系统在体外的抗肿瘤效应。【结果】经酶切鉴定和DNA序列测定,证明HSV1tk基因成功定向插入到pLXSN载体中;重组病毒DNA转染包装细胞,筛选出对G418具稳定抗性的克隆PT67/tk,扩大培养,获取病毒滴度为4×104?cfu/mL的重组逆转录病毒培养液;感染胃癌细胞SGC7901后再筛选出G418抗性克隆株SGC7901/tk。丙氧鸟苷(GCV)对SGC7901/tk有明显杀伤作用,对SGC7901无明显毒性,证明该病毒表达HSV1tk基因,表达产物具有生物活性。【结论】将HSV1tk定向克隆入逆转录病毒载体的方法可成功获取表达HSV1tk基因的逆转录病毒,成功建立了肿瘤自杀基因治疗系统,这将为进一步研究中医药对自杀基因抗肿瘤的增效作用奠定基础。
关键词:自杀基因; DNA,重组; 基因,肿瘤抑制; 基因疗法
肿瘤的基因治疗,特别是自杀基因治疗,已经成为继传统手术切除、放射治疗、化学药物治疗等疗法之后一种新的抗肿瘤治疗措施。目前应用的肿瘤自杀基因治疗系统主要有[1]单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶(VZVtk)、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(ECCD);P53等。单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSVtk/GCV)治疗系统为最常用、最重要的治疗系统之一。
HSVtk基因在肿瘤细胞内表达胸苷激酶,可催化核苷类似物,如丙氧鸟苷(GCV)等,形成单磷酸化产物,并在细胞内磷酸激酶作用下形成三磷酸产物,干扰细胞分裂时DNA合成,从而导致肿瘤细胞死亡[12]。
但由于在体内不可能每一肿瘤细胞都导入自杀基因,故旁观者效应(bystander effect)对基因治疗效果起到至关重要的作用。
旁观者效应不仅可使导入自杀基因的细胞杀死,还使邻近未导入的细胞也被杀死[34]。
研究表明,旁观者效应与机体的免疫状态密切相关[56];许多中医方药能有效提高机体的免疫功能[79],这就有可能通过调节自杀基因抗肿瘤作用的炎症免疫微环境,使荷瘤机体从免疫抑制转化为免疫激活,从而增强自杀基因的旁观者效应,起到协同抗肿瘤作用。这一研究工作必须在自杀基因治疗系统建立后才可进行。故本工作仅探讨了以逆转录病毒载体介导自杀基因抗肿瘤系统建立的方法。
1 材料与方法
11 细胞与质粒
pIC19R/MC1tk质粒(克隆了HSV1tk的载体质粒)由美国匹兹堡大学药理教研室Huang ,广州军区总医院赵亚刚博士提供;pLXSN逆转录病毒表达载体、病毒包装细胞PT67均购自美国Clontech公司;人胃癌细胞SGC7901和小鼠NIH3T3细胞均购自中山医科大学细胞库;Ecoli DH5
α菌株由本校生化教研室保存。
12 试剂
高纯度质粒提取试剂盒和DNA片段凝胶回收试剂盒均购自上海sangon生物工程技术有限服务公司;DNA片段连接试剂盒,购自广州宝泰克生物科技有限公司;转染试剂盒Polyfect Transfection为QIAGEN公司产品;多聚阳离子(Polybrene)、G418、GCV均为Sigma公司产品;DMEM、胎牛血清和RPMI1640均为Gibco公司产品;新生牛血清为杭州四季青公司产品。
13 质粒的抽提、酶切、DNA片段的连接、转化按Sambrook法或试剂盒产品说明书的方法进行,提取的质粒DNA浓度与纯度用RNADNA Caculator测定。
14 重组质粒的构建 pIC19R/MCItk质粒和逆转录病毒表达载体pLXSN质粒均转化DH5α后扩增、抽提纯化,均用限制性内切酶EcoR I/Bam H I 酶切,凝胶电泳证实pIC19R/MCItk质粒有17kb HSV1tk cDNA目的片段,回收、纯化此tk基因片段及pLXSN载体双酶切后的大片段,在适当的反应体系中用DNA片段连接试剂盒将tk基因定向克隆入逆转录病毒表达载体pLXSN中,构建成重组的pLXSNtk质粒。
15 限制性内切酶鉴定和序列鉴定重组质粒经转化、扩增、提纯后,采用EcoR I、BamH I单酶切和EcoR I/BamH I双酶切,酶切后采用琼脂糖凝胶电泳鉴定,图象分析仪拍照、分析。然后分别在pLXSN载