文档介绍：NT3基因逆转录病毒表达载体的构建
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:董智勇, 李忱, 陈东孟晓婷, 陈雷, 路来金
【摘要】目的: 分离大鼠神经营养素3(NT3)基因, 构建pLEGFPNT3逆转录病毒表达载体。方法: 利用RTPCR技术钓取大鼠NT3基因, 克隆到测序载体pMD18T中, 测序后再亚克隆到逆转录病毒载体pLEGFPC1中, 通过Lipofectamine 2000导入包装细胞PA317。结果: RTPCR产物为776 bp, 经测序鉴定虽与GenBank中NT3基因的序列相差1个碱基, 但不影响NT3蛋白质的表达; 构建的pLEGFPNT3重组载体经酶切鉴定, 证实NT3基因片段正确插入pLEGFPC1载体中。转染包装细胞后, 激光共聚焦显微镜下观察导入NT3基因的PA317细胞发绿色荧光。结论: 分离得到了大鼠NT3基因成功构建了pLEGFPNT3表达载体。
【关键词】神经营养素3; 逆转录病毒载体; 重组
神经干细胞(neural stem cells, NSC)的应用为脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)的治疗带来新的希望, 而NSC移植治疗SCI的效果直接与移植细胞在损伤局部的存活、功能性分化以及再生轴突能否与靶器官重建突触联系密切相关, 这三者主要是由损伤局部的微环境所决定的[1]。如何改善损伤微环境使其更有利于NSC的存活分化以修复SCI, 神经营养因子(neurotrophins, NTF)起着至关重要的作用。神经营养素
3(neurotrophin3, NT3)是在脊髓中作用最强的NTF, 它可以明显促进皮质脊髓束的再生和NSC的迁移与轴突生长[2]; NT3 能特异地提高出生后大鼠发育中皮质脊髓束侧枝发芽, 支配它的靶组织[3]。SCI后NT3 mRNA与蛋白质的表达与损伤前相比均有所提高, 说明受损脊髓对NT3内源性需求增加[4]。通过转基因技术, 可使含有NTF基因的神经干细胞(neural stem cells, NSC)不断分泌所需营养因子, 促使神经再生和功能恢复。本实验目的是利用RTPCR技术分离获得大鼠NT3基因, 并通过携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的逆转录病毒载体构建NT3基因的表达载体, 为进一步将NT3基因导入NSC内, 探讨应用转NT3神经干细胞治疗脊髓损伤的研究提供参考。
1 材料和方法
材料 dNTP、 DNA maker、 PCR产物回收试剂盒购自鼎国生物试剂公司; Tag plus DNA聚合酶、 T4 DNA连接酶购自Promega公司; Hind Ⅲ和BamH Ⅰ限制性内切酶、 pMD18T 载体购自TaKaRa公司; Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司; G418购自Gibco公司; Polybrene购自Sigma公司; pLEGFPC1购自BD公司; PCR引物由联星公司合成; PA317细胞购自第四军医大学实验动物中心。
方法
NT
3基因的调取、扩增、测序根据GenBank中大鼠NT3的基因序列(GenBank 登录号为M34643), 设计2条引物, 并加入2个酶切位点Hind III(AAGCTT)、 BamH I()和保护碱基: 5′ATCTTGTTTTATGTG3′; 5′GATTTTTCTTG3′; 扩增产物大小为776 bp。从出生2~3 d的大鼠脑纹状体中提取组织总RNA, 应用RTPCR法扩增NT3基因片段, 回收DNA与pMD18T 载体连接, 转化大肠杆菌JM109感受态细胞, 氨苄平板筛选后扩增重组质粒pMD18TNT3, 并进行小量提取, 测序。
表达NT3的逆转录病毒载体的构建提取质粒pGEMTNT3和pLEGFPC1, 分别用Hind III与BamH I进行双酶切, 琼脂糖凝胶电泳回收NT3与 pLEGFPC1片段, 将NT3用T4 DNA连接酶与pLEGFPC1载体进行连接, 连接子转化大肠杆菌JM109感受态细胞, 转化细菌涂布LB氨苄平板筛选阳性重组质粒, 挑取单菌落接种于2 mL LB培养液中, 37℃震荡培养过夜, 小提质粒, 用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切鉴定出重组质粒, 然后大量制备重组质粒pLEGFPC1NT3, -20℃备用。
逆转录病毒载体的包装和筛选 pLEGFPC1逆转录病毒载体中保留了病毒的包装信号以及介导病毒整合、具有启动子和加工功能的2个LTR。将其导入病毒包装细胞系