文档介绍：六月青石油醚萃取物体外对胃癌细胞SGC-7901 凋亡的影响及其作用机制研究
作者:张志伟,黄仁彬,王乃平
【摘要】目的研究六月青石油醚萃取物(petroleum ether extract of LYQ,LYQPE)对人胃腺癌SGC-7901细胞凋亡的影响及其部分作用机制。方法用不同浓度的LYQPE作用于SGC-7901,作用48 h后,流式细胞术检测对细胞凋亡及其凋亡相关蛋白p53影响;RT-PCR检测凋亡相关基因p53 mRNA和黏附基因CD44 mRNA的变化;电镜观察超微结构变化。结果LYQPE体外作用于SGC-7901,在40~320 μg/ml时呈不同程度的促进凋亡;呈剂量依赖性的抑制p53蛋白、mRNA水平和CD44 mRNA水平的表达;在160μg/ml时,电镜观察可见典型的凋亡形态学改变。结论LYQPE对SGC-7901有明显促凋亡作用;LYQPE抑制SGC-7901 p53蛋白、mRNA水平和CD44 mRNA水平的表达有可能是促进SGC-7901凋亡的作用机制。
【关键词】六月青石油醚萃取物;SGC-7901;流式细胞术;细胞凋亡;RT-PCR;电镜
胃癌是我国最常见的肿瘤之一,其死亡人数在我国居恶性肿瘤的首位[1]。手术对早期胃癌有较好的疗效,但对中晚期的胃癌疗效欠佳。因此寻找疗效好、副作用小的治疗方法仍是目前肿瘤研究的焦点之一。六月青系爵床科植物肖鸡笼的干燥地上部分,是一种广西民间草药。《本草拾遗》记载,其能活血、凉血、舒肝泻湿、消肿止痛,主要用于急慢性肝炎、黄疸等[2]。中医学理论中肝克脾,胃为脾之腑,胃与脾相表里,说明肝与胃是有中医理论功能联系的。前期实验对六月青各化学部位进行了初步筛选,结果表明六月青石油醚部位体外对胃腺癌细胞系SGC-7901和MKN-45有明显的抑制作用。关于六月青的研究资料报道中,石油醚部位能显著增加小鼠胸腺重量和小鼠血清溶菌酶的含量[3],表明六月青石油醚萃取物有一定的增强免疫作用。本实验室用醇提石油醚萃取的方法得LYQPE,经初步的实验,有较好的抗瘤效果,且未发现明显的毒副作用。本实验旨在研究六月青石油醚萃取物对人胃腺癌SGC-7901细胞凋亡的影响及其部分作用机制。
1材料与仪器
-7901胃癌细胞株由第四军医大学试验动物中心提供,由本实验室自行传代培养。细胞常规培养于含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液中,在37℃ 5% CO2及饱和湿度下培养,隔天换液,待细胞生长80%~90%密度时,%胰蛋白酶消化,按1∶2比例传代。
,采于广西灵山县,经广西中医药研究所鉴定,其地上部分粗粉用85%乙醇回流提取,过滤得滤液经旋转蒸发回收乙醇,浓缩液用溶剂石油醚萃取,萃取液经旋转蒸发回收石油醚后收集,恒温箱烘干得LYQPE备用;5-FU,上海旭东海普药厂,批号:061006; LYQPE用含10%DMSO的RPMI-,,, mg/ml的溶液各5 ml,备用。5-FU作为阳性药用含10% DMSO的RPMI-1640溶液配制成2 mg/ml的溶液5 ml,备用。
V凋亡试剂盒,Biovision公司;p53检测试剂盒,BD Bioscience公司;RPMI-1640培养液,购自美国Gibco公司; PBS,美国Gibco公司;胰蛋白酶,美国Amersco公司;Trizol,美国Invitrigen公司;First strand cDNA synt
hesis kit,美国MBI;DEPC美国Sigma公司;2×PCR TaqMix,Takara公司;PCR扩增引物,北京三博远志公司;戊二醛,美国Sigma公司。
200多通道PCR扩增仪,美国MJ公司生产;Epics XL流式细胞仪,美国Beckmon - Coulter公司生产。
2方法
-7901 1×105培养于50 ml培养瓶中24 h,LYQPE 设终浓度分别为40,80,160,320 μg/ml,5-FU 100 μg/ml和空白对照组。共同培养48h,%胰酶消化,PBS冲洗2次,用100 μl 含钙离子buffer重悬,加5 μl Annex V-FITC染料染色20~30 min,加5 μl PI燃料染色5 min,加入适量含钙离子buffer调整细胞浓度到1×105个/ml左右,上流式细胞仪检测。激发波长为488 nm,发射波长530 nm。
-7901细胞1×105培养于50 ml培养瓶中24 h,LYQPE 设终浓度