文档介绍：一、实验原理Trizol主要物质是异硫***酸胍,它可以破坏细胞使RNA释放出来的同时,保护RNA的完整性。加入***仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。无论是人、动物、植物还是细菌组织Trizol法对少量的组织(50-100mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≧1g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。Trizol试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。Trizol抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。主要试剂和器材Trizol溶液***仿异丙醇75%%无Rnase移液枪紫外分光光度计石英比色皿泳槽和模具电泳仪凝胶成像系统大肠杆菌实验步骤一.采用Trizol溶液提取细菌的总RNA挑取大肠杆菌菌单菌落培养至稳定期2、每管加入1mLTrizol溶液盖紧管盖激烈振荡15s室温静置5min4℃12000g离心10min取上清转入(约1mL)***仿()盖紧盖剧烈振荡15s室温静置3min4℃,12000g,离心10min,,测量其体积,加***仿时应充分震荡使其充分乳化。加入1倍体积的***仿,盖紧盖,剧烈振荡15s,室温静置3min,4℃12000g离心10min小心吸取上层水相,。()轻轻颠倒混匀,室温静置10min,4℃12000g离心10min,RNA沉于管底,小心吸去上清6、加1mL75%的乙醇(预冷),并轻柔颠倒,洗涤沉淀4℃7500g离心5min,小心弃上清,微离吸去剩余乙醇,室温干躁10min。各管用30μLDEPC处理过的双蒸去离子水溶解,55-60℃温育5min,分装,-80℃贮存(可贮存5周)。二.RNA浓度的测定取10µLRNA样品以双蒸水稀释至2mL转入预先以无水乙醇隔夜浸泡后晾干的石英比色皿中,小心排除气泡,以等体积的双蒸水作为空白对照。在紫外分光光度计中分别测定260nm、280nm的光吸收值。根据公式计算RNA的浓度。RNA浓度(µg/µL)=OD260×稀释倍数(200)×40(µg/mL)/1000纯RNA样品的OD260/~若低于该值,表明存在蛋白质污染,可重新用酚∕***仿抽提。RNA纯度为最高。三.RNA质量检测将RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测,目的在于检测23S和16S条带的完整性和它们的比值。一般认为如果23S和16S条带明亮、边缘清晰并且23S的亮度在16S条带的两倍以上则RNA的质量较好。(1)将洗净、干燥的电泳槽和模具水平放置在工作台上×TAE中,摇匀,在微波炉内将琼脂糖溶液以最短时间完全溶解(中火档2min),待冷却至60℃时,加入EB(终浓度为µL/mL),充分混匀。(3)插入适当的梳子,将温热的凝胶倒入胶模中,凝胶厚度为3~5mm,置于室温下凝固。(4)待凝胶凝固后,小心移去梳