文档介绍：实验一质粒DNA提取纯化、DNA电泳检测一、实验目的1(掌握质粒DNA的制备的原理和方法2(了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离二、实验原理1(质粒DNA的制备方法质粒(Plasmid)是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子,分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中,但在细菌细胞中含量最多。细菌质粒大小介于1,200Kb之间,是应用最多的质粒类群,在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。质粒DNA的制备包括3个步骤:?培养细菌,使质粒DNA大量扩增;?收集和裂解细菌;?分离和纯化质粒DNA。主要方法包括:碱裂解法:+1%SDS;煮沸裂解法:沸水煮沸40秒;SDS裂解法:10%SDS,一般用于质粒大量提取。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验选择碱裂解法提取质粒DNA。2(碱裂解法质粒DNA具特定的形态结构,在特殊的环境条件下,如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA变性,去除变性条件又可以使DNA复性。碱裂解法根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。SDS是一种阴离子表面活性剂,它既能裂解细菌细胞,又能使细菌蛋白质变性。SDS处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂,从而使质粒DNA及细菌基因组DNA从细胞中同时释放出来。细菌环状基因组DNA在操作过程中会断裂成线状DNA分子,,,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕结合在一起。,pH恢复至中性,因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确,而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会那么迅速而准确,它们相互缠绕形成不溶性网状结构,而复性的质粒DNA恢复原来构型,保持可溶性状态。通过离心,就可去除染色体DNA和蛋白质-SDS复合物等物质,最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA,乙醇或异丙醇沉淀就可得到纯的质粒DNA,之后可再用超离心、电泳、离子交换柱层析等方法进一步纯化质粒。3(质粒琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳技术(agarosegelelectrophoresis)是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。~。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子的高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA,也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子,如pUC19质粒,有3种构型:超螺旋的共价闭合环状质粒setup,graspingpartybuildingworkinnon-anizatio