文档介绍：货号:QS1207规格:50管/48样γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶(glutamatecysteineligase,GCL)说明书可见分光光度法注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。测定意义:GCL是GSH合成的限速酶,GSH对GCL有反馈抑制作用。GCL基因表达受多种因素调节,如氧化剂、抗氧化剂、生长因子和炎症因子等。GCL活性高低对GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影响。测定原理:在ATP和Mg2+存在下,GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸;同时ATP去磷酸化产生无机磷分子,通过测定无机磷增加速率,即可计算出GCL活性。自备实验用品及仪器:可见分光光度计、冷冻离心机、水浴锅、移液器、1mL玻璃比色皿、浓硫酸和蒸馏水。试剂组成和配制:试剂一:液体70mL×1瓶,4℃保存。试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加14mL蒸馏水充分震荡溶解。试剂三:粉剂×1瓶,4℃保存。。试剂四:液体16mL×1瓶,室温保存。试剂五:粉剂×1瓶,4℃避光保存。临用前加入30mL蒸馏水,充分震荡溶解后,(自备),边加边搅拌。粗酶液提取::按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。:直接测定。,调节波长到660nm,蒸馏水调零。:,依次加入试剂一240μL、试剂二260μL、试剂三60μL和蒸馏水120μL,混匀后盖紧,37℃水浴准确反应15min;再加入试剂四300μL,混匀后,25℃、8000g,离心10min,取上清500μL,加入试剂五500μL,混匀后盖紧,45℃水浴10min,冷却后测定660nm处吸光值,记为A空白管。:,依次加入试剂一240μL、试剂二260μL、试剂三60μL和上清液120μL,混匀后盖紧,37℃水浴准确反应15min;再加入试剂四300μL,混匀后,25℃、8000g,离心10min,取上清500μL,加入试剂五500μL,混匀后盖紧,45℃水浴10min,冷却后测定660nm处吸光值,记为A测定管。第1页,共2页注意:空白管只需要测定一次。GCL活性计算公式:标准曲线:y=,R2=(1).按蛋白浓度计算活性单位定义:37℃下,每毫克蛋白每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。GCL(μg/min/mgprot)=[(A测定管-A空白管)÷×V反总]÷(Cpr×V样)÷T=×(A测定管-A空白管)÷Cpr(2)按样本质量计算活性单位定义:37℃下,每克组织每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为为1个酶活单位。GCL(μg/min/g鲜重)=[(A测定管-A空白管)÷×V反总]