文档介绍：实验十一 细菌质粒DNA的提取和纯化一、实验目的:通过细菌质粒DNA的提取,掌握共价闭合环状DNA的提取方法。二、实验原理:1、细菌中有两种DNA,即染色体DNA和质粒DNA。2、质粒DNA的提取方法有三种:碱裂解法、煮沸法和去污剂(如Triton和SDS)裂解法。3、碱裂解法比较剧烈,可破坏碱基配对,使宿主细胞DNA变性,共价闭合环状DNA由于空间缠绕,两条链不会彻底分开。当外界条件到达复性条件时,质粒DNA的双链又迅速恢复原状,而较大的线性染色体DNA难以复性。当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时,蛋白质与DNA发生变性,当加入中和液后,质粒DNA分子能够迅速复性,呈溶解状态,离心时留在上清中;蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状,离心时可沉淀下来。纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如,氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法,但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA,经过苯酚、氯仿抽提,RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA,所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求,故在实验室中常用。三、实验材料:含有PMD19质粒的大肠杆菌(.)菌液四、实验用具和药品:实验用具:摇床、离心机、移液器及枪头、玻璃试管(15mL)及塞子、离心管()。实验药品:溶液Ⅰ(高压灭菌):50mmol/L葡萄糖25mmol/()10mmol/LEDTA()溶液Ⅱ(现用现配):2mol/LNaOH10%SDS(十二烷基硫酸钠)NaOH:SDS:ddH2O=1:1:8溶液Ⅲ:5mol/ 五、实验步骤:(一)细菌繁殖第1天晚上:吸取含质粒的菌液2μL,转移入2mLLB(加入相应抗生素),37℃,过夜振荡(200r/min)培养。(二)菌体收集第2天早晨(时间:约2-3h左右):1、,5000r/min离心30sec;2、弃上清(三)碱裂解法提取质粒DNA1、将上述沉淀重悬于100μL冰预冷的溶液Ⅰ中,剧烈震荡(须使沉淀完全分散)(葡萄糖:悬浮细胞;EDTA;抑制DNAase)2、加入200μL溶液Ⅱ,盖紧管口,轻柔颠倒离心管5~10次,该过程应小于5min;(NaOH:溶解细胞膜,释放DNA;SDS)        3、加入150μL冰预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口,温和地颠倒离心管5~10次,该过程大于5min;(乙酸钾:和SDS反应生成PDS(十二烷基硫酸钾),沉淀蛋白,同时体积较大的染色体DNA也一起沉淀;冰乙酸:中和NaOH)4、10000r/min离心5min;5、;6、加入2倍体积的无水乙醇,充分混匀,室温放置2min(若沉淀不充分,可加入1/10体积3mol/L的醋酸钠);7、10000r/min离心5min;9、弃上清,干燥沉淀;9、加TE溶解沉淀,保存。六、实验作业:思考本实验的关键步骤是什么?答:本实验的关键是溶液Ⅰ重悬须充分,溶液Ⅲ混合须温和。碱裂解法的关键是如何把握SDS-NaOH处理的时间。质粒制备过程中,如果质粒长时间暴露于NaOH,质粒