重组慢病毒载体介导KSHV分子开关蛋白Rta在PEL细胞中的表达及表达蛋白功能鉴定.doc

文档介绍：
重组慢病毒载体介导 KSHV 分子开关蛋白
Rta在 PEL 细胞中的表达及表达蛋白功能鉴
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陈菲,严沁,卢春**
(南京医科大学基础医学院微生物与免疫学系南京 210029)
摘要:目的:构建含卡波氏肉瘤病毒(Kaposi’s a-associated herpesvirus,KSHV)分子开关蛋白,即复
制和转录激活蛋白(replication and transcriptional activator,Rta)基因的重组慢病毒载体。方法:从真核表达
质粒 -Rta 中扩增出 Rta 基因, 插入 pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen 中,构建重组慢病毒载体
pHAGE-Rta。将重组慢病毒骨架质粒 pHAGE-Rta 与包装质粒 psPAX2 和包膜质粒 共转染 293 T 细
胞,通过荧光显微镜观察表达绿色荧光蛋白的 293 T 细胞占总数的百分比。收集病毒悬液,采用梯度稀释
法测定病毒滴度。以不同感染复数(MOI)的 Lentivirus-Rta 病毒量感染 BCBL-1 细胞, 72 h 后检测 Rta 基因
的表达,同时通过蛋白质印迹和病毒颗粒释放实验检测 KSHV 裂解期蛋白病毒白细胞介素-6(vIL-6)的表达
及子代病毒颗粒的产出。结果: 从真核表达质粒 -Rta 中扩增出 Rta 基因, 插入
pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen 后, 利用限制性内切酶酶切鉴定和核酸序列测定证实重组慢病毒骨架质粒
pHAGE-Rta 构建成功。通过慢病毒包装三质粒表达系统获得了表达 Rta 基因的重组慢病毒,测得滴度约为
2×107 efu/mL。以不同 MOI 的重组慢病毒感染 BCBL-1 细胞后, 72 h 后可检测到外源基因编码 Rta 蛋白的
表达,且其表达能够上调 KSHV vIL-6 的表达水平及促进子代病毒颗粒的释放。结论: 成功构建了含 Rta
基因的慢病毒表达载体,获得的重组病毒能够有效地感染 BCBL-1 细胞,并发挥激活 KSHV 裂解期复制的
生物学功能。
关键词:慢病毒; 复制和转录激活蛋白;卡波氏肉瘤病毒;病毒复制
中图分类号:R3
Construction and identification of the binant
expression lentivirus vector carrying KSHV Rta gene
CHEN Fei, YAN Qin, LU Chun
(Basic medical college,Nanjing Medical University Nanjing 210029)
Abstract: Objective: To construct the binant lentivirus carrying Kaposi’s a-associated
herpesvirus (KSHV) replication and transcriptional activator( Rta) gene. Methods: The fragment of
Rta gene from expressio