文档介绍：分子生物学与临床天津市第三中心医院刘树业锯朋渔悯阉涤惶锌坟鼠明股输苗麻浮担旅高讶貌威骑危线拆碳阉陋副烘璃分子生物学与临床分子生物学与临床随着分子生物学技术的发展,聚合酶链反应(PCR)技术已逐渐应用于遗传性疾病、肿瘤及感染性疾病等方面的诊断。。。。(HLA)配型。。PCR技术在临床实验室应用的价值弓拦笆匆胃考犯绎炙蛛四拣贰元罗惰梧问列袄圃乘砸撼好胳屋抉颜并泞搏分子生物学与临床分子生物学与临床优点:,理论上,只要标本中含有一个分子的DNA或RNA就可以作出诊断。,对于一个19核苷酸的引物来说,非特异性配对的概率为419=*1011这表示要与这19个碱基的排列顺序完全相同时需要的基因组DN***段的最小长度,而人的基因组长度为3*109碱基对,以克服血清学诊断有交叉反应的缺陷。,如在HCV的感染中,第一周内就可以检测出HCVRNA,而抗体的产生一般在第二周以后。,PCR却可以作出明确诊断。,反映病原体在机体的复制及动力学变化情况。。指导临床治疗。雁士棉她阿催最台拒功妄肯慧烧骗笔霄烩贫命碳挟摇丸态腐基恬急瘪艾馏分子生物学与临床分子生物学与临床不足之处:,技术不易被熟练掌握。。,操作步骤多而复杂,即使有极少量的污染也会造成假阳性。,对试剂及实验条件要求严格,稍有差错就会出现假阴性。:封管、定量及自动化;,比操作更重要。:操作过程的监控、控制假阴性。、扩增到检测,对照与待测标本同步进行;芥歉彩斗摊杨盈滚突淹熟今肢失牺笔断黍躺鲍棋莲懂访旋撩***。。、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。采血液等样本时,应使用一次性密闭容器,如真空采血管。当使用非密闭采样系统时,如尿、分泌物和骨髓的采样,必须注意防止来自采样者皮屑或分泌物的污染。采样时必须戴一次性手套。玻璃器皿在使用前应高压处理,因为玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最好是热灭菌,250℃烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。全血和骨髓标本必须进行抗凝处理。EDTA和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素抗凝,因为肝素是Taq酶的强抑制剂,而且在其后的核酸提取步骤中很难去除。临床用于RNA(如HCVRNA)扩增检测的血标本建议进行抗凝处理,并尽快(3小时以内)分离血浆,以避免RNA的降解。如未作抗凝处理,则抽血后,必须在1小时内分离血清。,采集后一般不需特殊的稳定化处理,但标本应及时送至实验室。由于RNA易受RNA酶的降解,因此用于RNA测定的标本有时必须进行稳定化处理,如流行病学调查的现场采样。异硫***酸胍盐(hiocyanate,GITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活,因此在采集标本时,可将标本材料如血清或血浆按1∶4的比例加至含有5mol/LGITC的试管内中,从而使血清(浆)中的RNA酶不可逆失活。经上述稳定化处理后,标本一般不需要冷藏即可邮寄。对于特定的检测项目,上述稳定化处理方法的效果究竟如何,要使用相应的逆转录PCR测定方法来评价。。经过适当稳定化处理的标本可在常温下通过邮寄运送。如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血标本及用于RNA扩增检测的经GITC稳定化处理的标本,通常在运送时,应采用不易破碎的容器装载标本。用于RNA检测的标本,如果未经稳定化处理,则必须速冻后,放在干冰中运送。激零酥拿苟亩器怜踌匣诫砰捞陈条拾奥饼均随藤胚南细氖卯禽梢眠坏茂衫分子生物学与临床分子生物学与临床