文档介绍：实验十PCR扩增DNA实验三PCR扩增DNA【实验目的】1(掌握PCR扩增DNA的技术及原理2(学****PCR扩增仪的使用【实验原理】聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)是一种体外DNA扩增技术,1985年由Mullis等人创立。该技术能在几小时的实验操作中,将人为选定的一段DNA扩增几百万倍,具有灵敏度高、特异性强、操作简便和应用广泛等优点,目前已成为分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段,另外在医学研究和医疗诊断中亦体现出极大的应用价值。PCR的工作原理类似于DNA的体内复制过程,是将待扩增的DN***断和与其两侧互补的寡核苷酸链引物经变性、退火及延伸三步反应的多次循环,使特定的DN***断在数量上呈指数增加。PCR扩增首先需要一对引物,根据待扩增区域两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸作为引物,引物序列将决定扩增片段的特异性和片段长度。反应体系由模板DNA、一对引物、dNTP、耐高温的DNA聚合酶、酶反应缓冲体系及必须的离子等所组成。PCR反应循环的第一步为加热变性,使双链模板DNA变性为单链;第二步为复性,每个引物将与互补的DNA序列杂交;第三步为延伸,在耐高温的DNA聚合酶作用下,以变性的单链DNA为模板,从引物3ˊ端开始按5ˊ?3ˊ方向合成DNA链。这样经过一个周期的变性——复性——延伸等三步反应就可以产生倍增的DNA,假设PCR的效率n为100%,反复n周期后,理论上就能扩增2倍。PCR反应一般30-40次循环,DN***段可放大数百万倍。常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增,变性温度为95?,复性温度为37?,55?,延伸合成温度为72?,DNA聚合酶为Taq酶(可耐受95?左右的高温而不失活),反应循环数为30。【实验材料】,台式高速离心机,移液器,经高压灭菌后的Eppendorf管,电泳仪。(1)模板DNA(µg/µl):用牙签挑取单菌落悬浮到50µl的裂解液中(裂解液1%TritonX-100,20mmol/lTris-,2mmol/lEDTA),95?温浴10分钟,10000rpm离心5分钟,取2µl上清液用于总体积50µl的PCR反应。(2)TaqDNA聚合酶(5U/µl),10×扩增缓冲液,dNTP(1mmol/L):购买(3)引物(100pmol/L):设计并合成与目的DNA两侧互补的引物内。【实验操作】1(准备PCR反应溶液(1)按以下次序,:10×扩增缓冲液10µl4×dNTPs(包括四种dNTP)8µl引物11µl引物21µl模板DNA1µl(10ng)TaqDNA聚合酶1µl()加水至终体积100µl(2)用手指轻弹Eppendorf管底部,使溶液混匀。在台式离心机中离心2秒以集中溶液于管底。(3)加石蜡油50µl封住溶液表面。2(PCR扩增反应将加好样品的Eppendorf管置于PCR扩增仪内,95?5分钟,使模板DNA完全变性。然后按95?变性1分钟,55?退火45秒,72?延伸1分钟,重复循环30次,循环结束后72?延伸8分钟。反应完毕,将样品取出置-4?待用。【实验结果】取出样品,进行琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰***电泳,溴化乙锭(EB)染色,观察DNA条