文档介绍：学位论文原创性声明嬲螋燃幽本人郑重声明,所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了论文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得中南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任。作者签名:日期:丛年』月兰日学位论文版权使用授权书本学位论文作者和指导教师完全了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定:即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版;本人允许本学位论文被查阅和借阅;学校可以将本学位论文的全部或部分ia容编入有关数据库进行检索,可以采用复印、缩印或其它手段保存和汇编本学位论文。保密论文待解密后适应本声明。作者签名:(参导师签名垒鱼日期:翟!!年上月堑目日期:垄!笠年』::以pDONR223一TRIM29为基因模板,PCR扩增TRIM29CDS区片段,将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,并回收TRIM29条带。用BglII、,然后进行连接。将重组质粒转化至大肠杆菌DH5ct中进行扩增,挑选kan+阳性克隆菌落,进行小规模质粒提取。将提取的质粒进行酶切鉴定及DNA测序鉴定。结果:1、将TRIM29的PCR产物进行电泳,,结果与预期结果一致。2、用BglII、EeoRI双酶切重组质粒,。结果与预期一致。3、将重组质粒进行DNA测序,将测序所得的序列和TRIM29基因片段序列进行比对,显示构建序列与预期序列完全一致,pIRES2一ZsGreenl—TRIM29质粒表达载体构建成功。结论:。关键词:TRIM29;质粒表达载体构建万方数据博士学位论文中文摘要第二部分TRIM29大幅提高P53突变型结肠癌细胞HT29对奥沙利铂的敏感性目的:探索在不同p53状态下,TRIM29对结肠癌细胞奥沙利铂敏感性的影响方法:选取P53野生型结肠癌细胞HCTl16和P53突变型结肠癌细胞HT29(R273H附录1)进行对照研究。,两株细胞生长速度的变化和奥沙利铂IC50的变化。结果:1、-TRIM29质粒后,HCTl16和HT29两株细胞TRIM29的mRNA和蛋白质表达水平均上升,提示转染成功。2、转染pIRES2tZsGreenl—TRIM29质粒后,HCTl16从第4天开始生长明显加快,到第7天时,。而HT29从第3天起生长速度比亲代细胞减慢,第7天时,转染组的细胞数约为亲代组细胞数的73%。3、—TRIM29质粒后,/L,,轻度降低了HCTl6对奥沙利铂的敏感性;/L,,显著提高了HT29对奥沙利铂的敏感性。结论:l、在结肠癌中,TRIM29对表达野生型P53的细胞,表现为促进肿瘤生长作用;而对表达突变型P53的细胞,表现为抑制肿瘤生长的作用。2、在野生型P53结肠癌细胞HCTl16中,TRIM29阻断P53功能能够增加细胞对奥沙利铂的耐药,但不显著。提示野生TTT万方数据博士学位论文中文摘要型P53与奥沙利铂敏感性轻度相关。3、在突变型P53结肠癌细胞HT29中,TRIM29能够大幅提高HT29对奥沙利铂的敏感性。提示TRIM29可能通过结合组阻断突变型P53功能来提高HT29对于奥沙利铂的敏感性,突变型P53与奥沙利铂耐药高度相关。关键词:HT29;HCTll6;TRIM29;奥沙利铂;P53突变第三部分HT29一OX耐药细胞模型的构建目的:构建P53突变型结肠癌细胞HT29耐奥沙利铂模型方法:利用低浓度持续培养法构建HT29结肠癌耐奥沙利铂细胞模型。首先在奥沙利铂浓度为4umol/L(1/3IC50)时培养HT29细胞2—4个星期,宜到细胞出现成倍数增长时,再在4umol/L继续培养2个星期,传代。将奥沙利铂浓度提高至6umol/L。按此循环,将奥沙利铂的浓度