文档介绍：PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳刘琳1131428环境科学一、。,并分析相应结果。二、(PCR)技术的原理类似于DNA的天然复制过程。在微量离心管中加入适量缓冲液,加入微量模板DNA、四种脱氧核苷酸(dNTP)、耐热Taq聚合酶及两个合成DNA的引物,而后加热使模板DNA在高温下(94℃)变性,双链解链,这是所谓变性阶段。降低溶液温度,使合成引物在低温(55℃)与模板DNA互补退火形成部分双链,这是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中温(72℃),在Tap酶作用下,用四种dNTP为原料,引物为复制起点,模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链,这是延伸阶段。如此反复,在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和DNA合成这一循环,使产物DNA重复合成,并在重复过程中,前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成,使产物DNA的量按指数方式扩增。经过30~40个循环,DNA扩增即可完成。,在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物,利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应,达到分离混合物的目的。三、实验材料仪器:PCR扩增仪、、、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。试剂:TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、两种引物、16S全长DNA样本、无菌ddH2O、模板DNA、TBE、琼脂糖、EB、显色剂。。根据计算,10×Buffer、1ul dNTP、ul341GC、ul534、ulTaq、ddH2O的比例配置足量的PCR反应体系。分别向9个薄壁管中分别加入24ul的反应体系,并分别添加8种不同的模版,并于第9个薄壁管中加入无菌ddH2O作为阴性对照。将薄壁管放入PCR扩增仪中,按照预定程序进行PCR扩增。其中循环过程需要达到30~40次。程序如下:预变性:94℃3min循环:94℃变性30s55℃退火30s72℃延伸30s末次延伸:72℃5minPCR扩增完成后,将样品取出并保存于15℃环境中。,放到一锥形瓶中,×TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化,溶液透明。摇匀,待冷却至60℃左右,在胶液内加入适量的EB。取有机玻璃制胶板槽,在一端插好梳子,在槽内缓慢倒入已冷至60℃左右的胶液,使之形成均匀水平的胶面。待胶凝固后,小心拔起梳子,使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。×TBE电泳缓冲液,至液面覆盖过胶面。取1μl缓冲液和5μl待测DNA样品混合后,用移液枪滴加至凝胶的加样孔中。接通电泳仪和电泳槽,并接通电源,调节稳压输出,电压最高不超过5V/cm,开始电泳。点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。观察溴酚兰的带(蓝色)的移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处,可停止电泳。在紫外***仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜,赶去气泡平铺