文档介绍：PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳刘琳1131428环境科学一、实验目的
.学****并掌握PCR扩增的基本原理与实验技术。
.对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。二、实验原理 1. PCR扩增
多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于 DNA的天然复制过程。在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板 DNA、四种脱氧核甘酸（dNTP）、耐热Taq聚合酶及两个合成 DNA的引物，而后加热使模板 DNA在高温下（94 C）变性，双链解链，这是所谓变性阶
段。降低溶液温度，使合成引物在低温（ 55 C）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是
所谓退火阶段。溶液反应温度升至中温（ 72 C）,在Tap酶作用下，用四种 dNTP为原料，
引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和 DNA合成这一循环，使产物
DNA重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物 DNA可作为后一循环的模板 DNA而参
与DNA的合成，使产物 DNA的量按指数方式扩增。经过 30〜40个循环，DNA扩增即可完成。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验
DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。
DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。该电
泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用 DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分
离混合物的目的。三、实验材料
仪器：PCR扩增仪、、、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。
试剂：TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、两种引物、16S全长DNA样本、无菌ddH2。、模板DNA、TBE、琼脂糖、EB、显色剂。四、实验步骤 1. PCR扩增本次试验选择细菌 16S rDNA V3区片段进行扩增。
根据计算，首先取离心管按照 10 x Buffer、1 ul dNTP、 ul 341GC、 ul 534、 ul Taq、 ddH 2O的比例配置足量的 PCR反应体系。
分别向9个薄壁管中分别加入 24 ul的反应体系，并分别添加 8种不同的模版，并于第 9个薄壁管中加入无菌 ddH 2O作为阴性对照。
将薄壁管放入 PCR扩增仪中，按照预定程序进行 PCR扩增。其中循环过程需要达到
30~40次。程序如下:
预父性：
94 C
3min
循环：
94 C
变性30s
55 C
退火30s
72 C
延伸30s
末次延伸：
72 C
5min
PCR扩增完成后，将样品取出并保存于 15 c环境中。
DNA琼脂糖凝胶电泳实验
，放到一锥形瓶中，加入适量的 HBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。摇匀，待冷却至 60 c左右，在胶液内加入适量的 EB。
取有机玻璃制胶板槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至 60 c左右的胶液