文档介绍：PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳刘琳1131428环境科学一、实验目的•学****并掌握PCR扩增的基本原理与实验技术。•对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验,并分析相应结果。二、实验原理PCR扩增多聚酶链反应(PCR技术的原理类似于DNA的天然复制过程。在微量离心管中加入适量缓冲液,加入微量模板 DNA四种脱氧核苷酸(dNTP)、耐热Taq聚合酶及两个合成DNA的引物,而后加热使模板DNA在高温下(94C)变性,双链解链,这是所谓变性阶段。降低溶液温度,使合成引物在低温(55C)与模板DNA互补退火形成部分双链, 这是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中温(72C),在Tap酶作用下,用四种dNTP为原料,弓I物为复制起点,模板DNA勺一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链, 这是延伸阶段。如此反复,在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和DNA合成这一循环,使产物DNA重复合成,并在重复过程中,前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成,使产物DNA的量按指数方式扩增。经过 30〜40个循环,DNA扩增即可完成。DNA琼脂糖凝胶电泳实验DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电, 在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。 DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物, 利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应, 达到分离混合物的目的。三、实验材料仪器:PCR扩增仪、、、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。试剂:TapDNA聚合酶、dNTRbuffer、两种引物、16S全长DNA羊本、无菌ddHO模板DNA、TBE琼脂糖、EB显色剂。四、实验步骤PCR扩增本次试验选择细菌16SrDNAV3区片段进行扩增。根据计算,、、、、。分别向9个薄壁管中分别加入24ul的反应体系,并分别添加8种不同的模版,并于第9个薄壁管中加入无菌ddfO作为阴性对照。,按照预定程序进行PCR扩增。其中循环过程需要达到30~40次。程序如下:预变性:94C3min循环:94C变性30s55C退火30s72C延伸30s末次延伸:,将样品取出并保存于 15C环境中。,放到一锥形瓶中,加入适量的。然后置微波炉加热至完全溶化,溶液透明。摇匀,待冷却至 60C左右,在胶液内加入适量的 ,在一端插好梳子,在槽内缓慢倒入已冷至 60C左右的胶液,使之形成均匀水平的胶面。,小心拔起梳子,使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。,至液面覆盖过胶面。取 1d缓冲液和5d待测DNA样品混合后,用移液枪滴加至凝胶的加样孔中。, 并接通电源,调节稳压输出,电压最