文档介绍：郑州大学
博士学位论文
三株霍乱弧菌基因组文库的构建与鉴定及含ctxφ阳性克隆子的
筛选
姓名:谢婧
申请学位级别:博士
专业:内科学(消化系病学)
指导教师:段广才
三株霍乱弧菌基因组文库的构建与鉴定及含粜克隆子的筛选论文摘要博士研究生谢婧郑州大学公共卫生学院郑州师段广才导研究背景爆发。年月,在印度和盂加拉国出现了一个新的血清群一群霍乱是由霍乱弧菌引起的急性肠道传染病,是我国传染病防治法中规定的甲类传染病,也是国际检疫的传染病之一。目前根据乖牟煌经有鲅G逍停暌郧埃挥夯袈一【芤鸹袈业牧餍泻的大流行,并暂时性地取代了占流行优势的血清群,并很快造成全球范围的流行,引起了全球学者的广泛关注。是近几年出现的新的血清型霍乱弧菌,其生存能力比突袈一苗的研制提供理论依据。目前关于在差异外,具有很多的相同或相似之处:嗤蛳嗨频亩玖σ蜃印⒍玖蚣其调控系统嗤笮〉南拗菩阅谇忻钙电泳分析相似的电泳型菌浚恍┭д咛岢鯲将会引起第八次霍乱的世界大流行。越来越多的学者致力于研究这种新型的霍乱弧菌的米源,为霍乱的预防和控制及霍乱疫的来源主要有三种观点:~种观点认为是由槐涠吹摹隕相比,除菌体抗原与糯ǖピ5氖考捌湓谌旧逯械奈恢没鞠嗤主要毒力基因高度同源三株霍乱弧菌基因组文库的七勾建与鉴定及含懈招钥寺∽拥纳秆郑州人学博十学位论文
研究目的实验方法的保守序列嗤亩ň右蜃覶及其调控系统。这些都提示可能是腛抗原突变型,是竦昧瞬糠志蹇乖蛲庇侄Jб恍┗而变异的结果。另~种观点认为是由非群菌株获得了亩玖具有非群霍乱弧菌的某些特征:如还携带有质粒等。有学者甚至提出于环境中,由于一些有利条件的变化使它们成为优势克隆群而造成霍乱的流行。由于霍乱弧菌毒力相关基因总是成簇地位于染色体上,而且一般都在几至几十之间,难以用一般的ɡ┰霾⒖寺≌庑┗颍飧袈一【难芯看的来源还不清楚,导致的出现的已进行了大量的研究,并取得了一定的成果,但对于其来源问题,但到目前为止,我国年在新疆某地首次爆发了由引起的霍乱,虽然目前主要由主要引起散发,但引起的病例有逐年增加的趋势。很多学者对我国新疆年分离的究,结果表明新疆分离的菌株与印度和孟加拉国分离的菌株有较小的差异,不属于同一基因型,但这也不能排除该菌株为输入性菌株的可能。及其来源,本研究拟选用可以插入大片段恼沉为载体,构建新疆群菌株⒐罕曜贾闙幕蜃槲目猓貉∮胮质粒为载体,尝试插入较大的危⑿陆瓻的基因组文库,并对三个菌株的基因组文库的质量和实用性作了评价:基组文库中筛选出霍乱弧菌的主要毒力基因簇难粜钥寺∽樱⒍云浔判蟹治觯袈一【某Χ舅鼗及其启动子序列。本研究的来源及构建霍乱的疫苗奠定坚实的基础。沉;蜃槲目獾墓菇ǎ河肧裂解、酚氯仿抽提的方法提取霍乱弧菌的基因因而来的,因为具有的荚膜结构、部分本来就存在来了不便。因此到目前为止,因素也仍然是一个谜,虽然近几年来各国学者对的来源还不清楚,还需做大量的工作。鸹袈伊餍校琕的分子生物学特征进行了研为了更进一步了解我国新疆分离的菌株的分子生物学特征突袈一【疆为研究我国组;蜃镈经部分酶切大小为或左右的郑州大学博士学位论文三株霍乱弧菌基因纽文库的构建与鉴定及含餮粜钥寺∽拥纳秆~
嗔硬镒;蟪Ω司鶷,应用蓝白筛选实验筛选阳性克隆片段。部分酶切的斡眉钚粤姿崦腥チ姿峄,利用氨苄抗性筛选阳性克隆,柿N目獾墓菇ǎ航左右的酶切斡刖瑽酶切、处理的嗔樱硬镒;蟪Ω司鶷。利用蓝白筛选实验筛选阳性菌落,该基因组文库以格式化形式保存。馗咝帘昙翘秸氲闹票福捍罅刻崛『琧插入片段的重组质粒用虷双酶切,经琼脂糖凝胶电泳,用公司的回收试剂盒回收的目的片段作为从Φ哪0濉2捎肞掺入法制备蜃槲目庵衏阳性克隆予筛选与鉴定:采用菌落原位杂交从基因组文库中初步筛选粜钥寺∽樱⒃擞么虻阍咏弧肿釉咏弧⑻匾霵等方法对粜钥寺∮杞ú郊ā甤蔚难强寺。貉∮檬实钡南拗菩阅谇忻该盖衏中阴性克隆子,根据分子杂交的结果判断目的条带的位置并回收该片段,通过与适当的载体相连接,连接产物转化大肠秆菌堇蹲允笛樯秆⊙粜钥寺∽印阳性克隆予的限制性内切酶物理图谱构建方法:选用质粒上有一个或多个酶切位点的多种限制性内切酶、,相,应用图象处理软件对电泳的条带进行数据化处理,利用。砑允萁写矸治觯扑愀鞲鎏醮姆肿恿浚疨产物,回收后与经虰消化、回收的质粒载体二株霍乱弧菌基因纽文库的构建与鉴定及含鱩性克隆子的筛选的斡刖璛咝曰チ姿峄酶切的的载体臂相连接,连接产物用删灏暗鞍谆旌衔锾逋獍拔>攀删蹇粒,九噬菌体颗粒转染大肠杆菌并以混合池的方式保存该基因组文库。地高辛标记的秸搿酶切重组质粒,酶切产物经%琼脂糖凝胶电泳、紫外灯下照分析单酶切和双酶切的酶切图谱,确定限制性内切酶数目和位置,绘制出阳性克隆子的限制性内切酶物理图谱。虻目寺。鹤孕猩杓埔铮擞肞扩增含启动子序列琍引物的两端分别加上虰的酶切位点