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Asp4412121言郥11引1282月光谱学与光谱分析Mb44PCR术将肌红蛋白基因上的第位天冬氨酸的密码子槐涑衫蛋彼岬拿苈胱覣,获得突变体基因,将突变体基因克隆在肌红蛋白表达质粒上,转化大肠杆菌,突变蛋白在大肠杆菌中大量表达,收集菌体。酶法裂解细菌,依次用硫酸铵沉淀、离子交换柱层析、凝胶柱层析分离纯化得突变肌红蛋白。用圆二色谱分别研究野生型肌红蛋白及其突变体的耐热及耐酸的变性过程。实验结果表明:用碱性氨基酸〈嵝园被酇残基,增强了肌红蛋白耐热变性能力,导致蛋白质m719751关键词肌红蛋白;定点突变;圆二色谱;蛋白质结构;结构稳定性Q5184A文章编号:—蛋白结构的稳定及正确的折叠是它们执行各种生物功能的基础。大量的实验结果及理论计算表明:疏水核的堆积、二硫键、盐键、氢键及内在二级结构的倾向性对蛋白结构的稳定至关重要’。长期以来人们认为蛋白表面的氨基酸残基暴露在溶剂中,对蛋白的稳定性影响甚微。但最近几年研究成果对这一观念提出了质疑,发现蛋白表面带电氨基酸残基对蛋白的稳定性及性质具有非常大的影响,从而开辟了通过优化蛋白表面电荷与电荷的作用来调节蛋白结构稳定性及功能的新思路睁。(Mb)153链和辅基血红素组成的。在生物体中担负着重要的储存氧和[6]肌红蛋白稳定性及性质的影响已有很多报道,但大都集中在研究抹香鲸肌红蛋白血红素周围氨基酸或疏水氨基酸的作用卅。作者前期的研究发现当将马心肌红蛋白表面位氨基酸从天冬氨酸突变为赖氨酸后,突变肌红蛋白与细胞色素之间的电子转移速率提高了一个数量级,但这一蛋白表面氨基酸对马心肌红蛋白结构稳定性的作用未见报道。各[11-14]于圆二色谱法可以研究在不同条件下蛋白二级结构折叠状态[15-17]结构稳定性中发挥的作用,本文用圆二色光谱初步探讨马心肌红蛋白突变体的蛋白结构稳定性。试剂和仪器SigmaT4DNADNAPstIBamHI购自大连宝生物公司。含有编码野生型马心肌红蛋白基因的表达质粒,由美国HoffmanMilliporeQ(JascoSpectropolarimeter)(aSpectrophotometer层析系统实验方法突变蛋白的制备Lys44Mb-F肞定点突变的方法构建肌红蛋白突变基因,含有突变基因的质粒转染至(DE3)vol-28No2pp42642911160242116622UniversityB,。疓琇一2006II182007-0226基金项目:国家自然科学基金项目和教育部留学归国人员启动基金项目资助作者简介:王静云,女,年生,大连理工大学环境生命学院副教授:.,121疶con
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3病āC恳桓鑫露认律次。2·こ獶。209409啪;衄2光谱学与光谱分析[8]消光系数122用的磷酸钠缓冲液配制蛋白质溶液,·实验采用圆二色谱仪controller)011cin品池测定波长范围am(10甿·及蛋白浓度tmmolL-1)CD围为~℃,每次在测量温度下温育,扫描速度123pHpH(o2~渲频鞍字嗜芤.,室温下放置hCD122温度对肌红蛋白及其突变体结构稳定性影响的光谱图是远紫外区肌红蛋白突变体在温度为,,,℃的圆二色散光谱,野生型肌红蛋白显示与之相似的光谱菸戳谐。从图可以看到:随着温度的不断上升,肌红蛋白及222Φ母悍迩慷戎鸾ソ档停媸保nln90206rlITlp升高明显下降。图列出肌红蛋白