文档介绍：分类号 学校代码 10129
U D C 577 学号 08100007
Ghrelin 对绵羊卵母细胞体外成熟影响的研究
Effects of Ghrelin on the Ovine Oocytes During in vitro Maturation
申请人:白瑞霞
学科门类:农学
学科专业:基础兽医学
研究方向:动物组织胚胎与发育生物学
指导教师:曹贵方教授
论文提交日期:二〇一一年四月
摘要
Ghrelin是日本科学家Kojima1999年发现的一种由28个氨基酸组成的新的内源性
脑肠肽,是生长激素促分泌素受体(growth hormone secretagogue receptor, GHS-R)的天
然配体。Ghrelin与其受体结合后有着广泛的生理功能。因此,Ghrelin的研究进展是目
前人们所关注的一个热点。
随着动物细胞工程、胚胎工程研究的不断深入,影响动物卵母细胞成熟因素的相
关报道主要是一些生殖激素的相关作用原理。那么Ghrelin作为生长激素促分泌素受体
的天然配体,它是否参与了绵羊卵母细胞成熟,是否通过经典的与细胞生长有关的
MAPK信号通路发挥作用至今未见报道。由于卵母细胞在成熟过程中部分发生凋亡,
而抗凋亡基因Bcl-2与促凋亡基因Bax的表达状况决定了雌性生殖细胞存活与否,
Ghrelin在卵母细胞成熟过程究竟与Bcl-2和Bax有何关系目前尚不清楚。针对以上这些
悬而未决的问题本论文通过在绵羊卵母细胞体外成熟体系中添加Ghrelin以及Ghrelin
的受体(GHS-R)特异性拮抗剂D-Lys3-GHRP-6,研究了Ghrelin在绵羊卵母细胞成熟
过程中的作用,与MAPK信号级联以及Bcl-2和Bax的关系,结果如下:
1、Ghrelin 受体 GHS-R 在绵羊卵母细胞的表达
采用 RT-PCR 技术成功检测到 Ghrelin 受体 GHS-R 在绵羊卵母细胞的表达。
2、Ghrelin 对绵羊卵母细胞成熟的影响
(1)Ghrelin 对卵母细胞第一极体排出率、核成熟率有促进作用。而且呈浓度依赖
性。
(2)D-Lys3-GHRP-6 作为 Ghrelin 受体 GHS-R 的特异性拮抗剂对卵母细胞第一极
体排出率、核成熟率无影响。
(3)D-Lys3-GHRP-6 可阻断 Ghrelin 对卵母细胞体外成熟的促进作用,且对 GHS-R
拮抗的越完全,Ghrelin的促进作用被阻断的越显著。说明Ghrelin是通过与受体GHS-R
的结合而发挥其对卵母细胞的促成熟作用的。
3、实时荧光定量 PCR 检测 Ghrelin 对绵羊卵母细胞 MAPK(ERK1/2)、p90rsk mRNA
表达的影响
(1)Ghrelin 对卵母细胞 MAPK(ERK1/2)、p90rsk mRNA 的表达有上调作用,且存
在着明显的剂量、时间依赖关系。
(2)D-Lys3-GHRP-6 对卵母细胞体外成熟时 MAPK(ERK1/2)、p90rsk mRNA 的表达
没有影响。
(3)Ghrelin 对 MAPK(ERK1/2)、p90rsk mRNA 表达的促进作用可被 Ghrelin 受体
(GHS-R)拮抗剂 D-Lys3-GHRP-6 阻断,且此阻断作用呈浓度依赖性。
4、Western blotting 检测 MAPK(ERK1/2)、p90rsk 蛋白在绵羊卵母细胞的表达及 Ghrelin
对磷酸化的 MAPK(ERK1/2)、p90rsk 蛋白表达的影响
(1)MAPK(ERK1/2)、 p90rsk 蛋白在卵母细胞体外成熟过程中表达量没有明显变
化。
(2)卵母细胞体外成熟 10h 时, MAPK(ERK1/2)、 p90rsk 被激活,直到 24h 仍维
持高活性。说明卵母细胞 MAPK(ERK1/2)、 p90rsk 是在 GVBD 期后被激活的。
(3)Ghrelin 对 MAPK(ERK1/2)、 p90rsk 蛋白的表达有上调作用。
(4)Ghrelin 对 MAPK(ERK1/2)、 p90rsk 蛋白表达的上调作用可被 D-Lys3 -GHRP-6
阻断。
(5)在卵母细胞体外成熟过程中 p90rsk 的激活与 MAPK(ERK1/2)一致。
(6)Ghrelin 在卵母细胞体外成熟中所起作用是通过 MAPK 信号系统发挥效应的,
其增加卵母细胞 GVBD 后磷酸化的 MAPK(ERK1/2)、 p90rsk 的表达是通过 Ghrelin