实验二(研究生分生).ppt

文档介绍：实验二总RNA提取、RT-PCR制备cDNA及DNA克隆TotalRNAPreparation,cDNApreparationbyRT-PCR,andDNAcloning实验二和实验三是以获取纯化的表达蛋白质为目的,从RNA提取开始,经过RT-PCR获取特定基因的cDN***断,再进行重组、筛选获取克隆,最后进行基因编码蛋白质的表达、纯化、和检测。;;-;-PCR产物的纯化;;;,DNA浓度的微量测定;;TotalRNAisolationfromtissuesbyOne-StepRNAPurificationMethod1、取小鼠,断颈处死,用剪刀沿小鼠枕骨断开小鼠颈椎,露出枕骨大孔,然后从枕骨大孔分别向两侧剪开小鼠颅骨,用镊子小心向上掰开顶骨,取出暴露的大脑。(取出肝脏-20℃冻存)实验步骤:第一天2、玻璃匀浆器中加入4ml的RNAiso试剂置冰上待用。3、立即取出脑组织,移入玻璃匀浆器中,立即在冰浴中上下研磨十次左右进行匀浆。4、然后将匀浆液平均转移入4只2ml离心管中,室温静置5分钟。第一天5、***仿,盖紧管口,用力颠倒离心管3-5次进行混合,室温再静置5min后。6、12000rpm4℃离心10min;,每只600μL。7、加入600μL异丙醇,颠倒混匀后室温静置5-10min,15000rpm离心5min。,加入1mLDEPC处理过的75%乙醇,振荡片刻,再于15000rpm离心5min;再次去净上清,敞口室温静置5-15min,待RNA沉淀略干。,4℃保存备用。第一天RNA含量的紫外分光光度计测定DeterminationofRNAcontentsbyUV-Spectrometer操作:取两只比色杯,一只加入1470μLDEPC处理过的蒸馏水,再加入30μLRNA液;,分别测定其在260nm和280nm的光吸收值,计算出二者的比值与RNA溶液浓度。第一天