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SiRNA 与 RNAi 实验技术手册
RNA 是生物体内最重要的物质基础之一,它与 DNA 和蛋白质一起构成生命的框架,但长
久以来,RNA 分子一直被认为是小角色。然而,一系列发现表明——这些小分子 RNA 事实上
操纵着许多细胞功能。它可通过互补序列的结合反作用于 DNA,从而关闭或调节基因的表达。
甚至某些小分子 RNA 可以通过指导基因的开关来调控细胞的发育时钟。RNA 干涉(RNAi)是
在线虫中发现的,在 1998 年的一篇 Nature 论文中被公诸于众。此后,科学家们还明白,
RNAi 还有其他形式,它既是一种了解基因功能的强大工具,又是很多生物的基因组所采用
的一种在演化上来讲很古老的防卫方法。
一、什么是 siRNA 和 RNAi?
双链 RNA 经酶切后会形成很多小片段,称为 siRNA,这些小片段一旦与信使 RNA(mRNA)
中的同源序列互补结合,会导致 mRNA 失去功能,即不能翻译产生蛋白质,也就是使基因“沉
默”了,双链 RNA 对基因表达的阻断作用就被称为 RNA 干预(RNA interference, RNAi )。
二、RNAi 的作用机制是什么?
目前 RNAi 的作用机理主要是在线虫,果蝇,斑马鱼等生物体内阐明的。生物体内的双
链 RNA 可来自于 RNA 病毒感染、转座子的转录产物、外源导入的基因。这些来源的双链 RNA
诱发了细胞内的 RNAi 机制,结果是病毒被清除、转座子的表达被阻断、外源导入基因表达
被阻断,同时与其同源的细胞基因组中的基因表达也被阻断。
通过生化和遗传学研究表明,RNA 干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and
effector steps)。
A、在起始阶段,加入的小分子 RNA 被切割为 21-23 核苷酸长的小分子干扰 RNA 片段
(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明;一个称为 Dicer 的酶,是 RNase III 家族
中特异识别双链 RNA 的一员,它能以一种 ATP 依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因
病毒感染等各种方式引入的双链 RNA,切割将 RNA 降解为 19-21bp 的双链 RNAs(siRNAs),每
个片段的 3’端都有 2 个碱基突出。
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B、在 RNAi 效应阶段,siRNA 双链结合一个核酶复合物从而形成所谓 RNA 诱导沉默复合
物(RNA-induced plex, RISC)。激活 RISC 需要一个 ATP 依赖的将小分子
RNA 解双链的过程。激活的 RISC 通过碱基配对定位到同源 mRNA 转录本上,并在距离 siRNA3’
端 12 个碱基的位置切割 mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了,但每个 RISC 都包含一个 siRNA
和一个不同于 Dicer 的 RNA 酶。
另外,还有研究证明含有启动子区的 dsRNA 在植物体内同样被切割成 21-23nt 长的片段,
这种 dsRNA 可使内源相应的 DNA 序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默.
三、如何进行 RNAi 试验的设计?
RNAi 研究的一般技术路线一般如下:
由上述的路线可以看出,获得高纯度的siRNA产物是进行实验的第一步,而转染的
效率则是非常关键的因素。
A、设计siRNA序列
1、在设计RNAi实验时,可以先在以下网站进行目标序列的筛选
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hlib/misc/
.edu/Stu/shilin/
http://design./rnadesign/?SID=45358710
2、RNAi目标序列的选取原则
(1)、从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始,寻找“AA”二连序列,并记下其 3'端的 19 个
碱基序列,作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在 45%—55%左右的siRNA要比
那些GC含量偏高的更为有效。
Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对 5'和 3'端的非编码区(untranslated regions,
UTRs),原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区