厦华的八大失误及对策.pdf

文档介绍：原位PCR和原位RT-PCR操作规程
一、仪器设备
英国Thermo Hybaid原位PCR仪。

二、操作流程
1、原位PCR步骤
1)预处理:
(1)切片常规脱蜡;
(2) HCl处理 10min;
(3)5μg/ml蛋白酶K消化组织 37℃10min;
(4)Nase消化组织 37℃ 30min;
(5)梯度酒精脱水,室温干燥。
2)原位扩增:
(1)切片滴加特异性序列引物 30μLPCR扩增反应液,覆盖硅化盖玻片,石蜡油封边;
(2)PCR热循环:94℃,1min;55℃,1min;72℃,,共 25~30 个循环,72℃延伸
10min;
(3)氯仿洗去盖玻片,4%多聚甲醛后固定 10min,梯度酒精脱水,干燥。
3) 原位杂交:
(1)加地高辛标记探针的杂交液,98℃变性 10min,-20℃退火 5min,42℃杂交过夜。
(2)杂交后用 2×SSC洗涤 10min,3 次,1×SSC洗涤 10min,3 次;
(3)缓冲液洗涤 10min,3 次;
(4)加碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体复合物,37℃,2h;
(5)缓冲液洗涤 5min,3 次;
(6)NBT、BCIP暗处显色,镜下控制,终止显色。
(7)常规脱水:透明、封固。
2、原位RT-PCR步骤
1)预处理:
(1)蛋白酶K() 54℃消化 20min,蒸馏水洗;
(2)95℃加热 3min,灭活残存的蛋白酶。
2)原位扩增:
1
热线电话:[phone] 8009881995 E-mail:******@.cn 网址:
(1)在有RNA酶抑制剂存在的条件下,用随机六聚物进行逆转录反应;
(2)用热启动法进行PCR扩增。标本加热至 75℃时加上反应液,覆以盖玻片,四周用指甲
油密封。然后将温度升至 95℃,2min。再将热循环仪设定为 95℃,45s,55℃,1min和 75℃,45s,
共 26 次循环;
(3)扩增结束后,在 80℃烤 15min~30m