文档介绍：河北师范大学
硕士学位论文
中华鳖群体死亡症病原菌的分离鉴定及其预防的研究
姓名:钱明明
申请学位级别:硕士
专业:微生物学
指导教师:赵宝华
20100412
摘要
气单胞菌属(Aeromonas)是一类严重危害人和水产经济动物的常见致病菌。近几
年,高密度人工养鳖业的迅速发展,鳖病也随之大面积暴发,造成了严重的经济损失。
2008 年,石家庄周边养鳖场暴发群体死亡,继而全省都有发现,给当地养殖户带来巨大
损失。
本研究从群体死亡的的中华鳖病灶部位分离得到一株病原菌 HBJY01,采用传统鉴
定方法并结合分子生物学方法,鉴定该菌的属种。用 16S rRNA 和 gyrB 基因通过构建系
统进化树和计算序列两两间遗传距离的方法,探讨气单胞菌的进化地位。结果表明传统
鉴定方法与分子生物学方法鉴定结果一致,HBJY01 的 16S rRNA 和 gyrB 基因与维氏气
单胞菌的相应基因同源性分别为 99%和 95%。人工感染实验结果表明 HBJY01 感染健康
中华鳖,死亡率 100%,症状与群体死亡的中华鳖大体相同。取其病变肝脏分离到相同
病原菌。进而根据 GenBank 报道的维氏气单胞菌外膜蛋白 A 基因和嗜水气单胞菌 hly
基因序列分别设计了两对引物,PCR 扩增得到 ompA 和 hly 基因。序列分析表明,其片
段大小分别为 1000bp 和 1500bp,与参考序列同源性分别为 %和 %。分别将
ompA 和 hly 基因定向克隆于原核表达载体 pET-28a,构建了重组质粒 pET-ompA 和
pET-hly,又将 hly 基因片段构建到 ompA 基因的下游,得到融合质粒 pET-ompA-hly。
将三种重组质粒分别转化受体菌 BL21,得到的阳性重组菌株 BL21(DE3)(pET-ompA)、
BL21(DE3)(pET-hly)和 BL21(DE3)(pET-ompA-hly),经 IPTG 诱导后,SDS-PAGE
结果表明均有目的蛋白表达;Western blot 检测证明表达的目的蛋白为特异性产物。对
成功构建的基因工程菌株 BL21(DE3)(pET-omp-hly)分别从温度、诱导时间、IPTG
浓度方面进行诱导条件的优化,结果表明在 37℃,诱导时间 6h,IPTG 浓度为
时,蛋白表达量最高,并对基因工程菌株 BL21(DE3)(pET-omp-hly)进行动物保护性
实验。ELISA 和组织切片结果显示基因工程菌株具有较好的免疫保护效果,抗体效价为
1:1600。为找到切实可行的免疫途径,本研究采用生物可降解高分子材料 PLGA,通
过 W/O/W 法制备口服缓释微球,并对制备工艺进行初步优化,制备得到包封率为 %,
外观较好的微球。免疫动物实验结果表明保护率较高,达 95%,口服免疫后检测抗体水
平结果显示,经微球口服免疫的抗体水平较高并且免疫期较长,二免后 40 天抗体依然
呈阳性,为该病的预防奠定了基础。

VI
关键词:维氏气单胞菌融合蛋白基因工程疫苗缓释微球

VII
Abstract
Aeromonas is one of the pathogens which influence individuals and water-living
economic animal. Due to the swift progress of high density turtle-cultivating enterprise,
diseases, which make severe economic damage, come up in a large scale. A colony of turtles
died for unsure reasons in Shijiazhuang in 2008, and then similar cases occurred in all areas in
Hebei province.
The research got pathogen HBJY01 from the lesion site of the turtles and used traditional
technology and molecule biology technology to identify what category the pathogen belongs
to. Establish ic tree with gene 16SrRNA and gene gyrB, and ca