文档介绍：浙江大学
硕士学位论文
16S rRNA基因荧光定量PCR-基因芯片杂交法的建立及其应用研
究
姓名:杨祖钦
申请学位级别:硕士
专业:儿科学
指导教师:尚世强
20060501
基因荧光定量换蛐酒咏技术的建立及其应用研究中文摘要第一部分浙江大学医学院硕士研究生儿科学杨祖钦尚世强主任医师基因荧光定量换蛐酒咏患际醯慕导师阳性菌卜于其他特异性菌属的探针,制成基阕芯片,通过对标准菌株、阴性对照组⒉∫洌俅仓⒆次尢匾煨裕婊钭庞邢一部分发生后遗症。因此,寻找快速、敏感而特异的新叫躂蛑⒃缙谡锒现标,对指导临床治疗、降低新生儿死亡率、改善预后,具有种匾5囊庖濉T箍冈序列,在其保守区设计引物和探针,进基冈荧光定量甹牿冈芯片杂交相结合的方法快速检测细菌③趿俅脖瓯窘屑觳犟闪荧光定量;咏基因保守区域设计通川引物,并在该引物的扩增的区域内设定⋯条通川荧光探针。对阳性标准菌株组、阴性对照组进行荧岸縋检测、分析。同时在细菌基因保守区设计引物,设置区分革兰氏阴性菌、新生儿败血症本研究我们分析细菌行荧光定量痡基因芯片杂交分析,最终建立了细菌取得良好效果。本研究分二部分:第一部分,基因荧光定量冈芯片杂交技术的建立;筇二部分,技术的临床应川研究。方法:在细菌的进行芯片荧光杂交、洗脱、扫描,最后进行分析。浙江大学硕上学位沦文
第二部分基因荧光定量换蛐酒咏患际醯牧俅灿用研究结果结论可‘次检测。此项复合方法可为细菌感染的早期、快速诊断提供新的有效手段。方法:本院新生儿、重症监护室∏酆喜》苛俅材庹镂;阅直曜季旯杲杏ü舛縋募觳猓峁球菌及白色念珠菌,人基因组鲜龇椒ḿ觳饩R跣浴<基因细川质粒作为稀释滴度,:株菌其—觳饬槊羝じ撸缓氖鄙伲徊皇鼙瓯拘〈嬖诳咕┪锘蚱渌志镏实干扰:定量分析准确,有助于评价治疗效果、判断预后,有效解决了廴疚题。幕阕芯片其杂交敏感性高,能检出特殊培养,难以培养等细菌;可检测任何膜炎的住院患儿标本例,每例均抽取脑脊液鋜养,⒌淖≡夯儿瓯荆坷槿【猜鲅8鱨分别行皿培养和细菌阳性,其值在.~.之问。巨细胞病毒、病毒、乙肝病毒,新型隐菌荧光定量韵妇懈叨鹊奶匾煨裕肴嘶颉⒄婢虿《局饰藿徊娣从Α/范围内,荧光定量曲线所测的值依次递增,最低可以检测到个拷贝数,即相于鱿妇探针和通用探针均阳性,L秸胍跣裕闓一葡珿。探针和通用探针均阳性,探针阴性,均能与相应特畀的探针发牛杂交,表明皋网芯片杂交不仪能区分/痪⒛苊魅废妇辍无菌体液,如血、脑脊液、胸水等;最快奔觳猓哂懈哂啃裕喔蓔项广髂约挂合妇浙江大学硕宦傥
结果:一、在化脓性脑膜炎上的应用二、在败血症上的应用:.换孕酒咏患觳狻.,值小于的为细菌荧光定量粜裕峁ü阳性率仪.,前者明显高于后者,,,,鼵荧光定量粜员瓯窘ú叫酒咏唬峁莼芯片杂交均阳性,其金葡菌探针阳性荩鞲惺取綶【司秸胙粜份,无乳链球菌探针阳性荩牟庑蛭垂崾鞠妇奖词系停庑蛭茨芡瓿桑肫鋍蹈摺细菌培养阴性均棚符合。瓯基因荧光定量觳飧蕉荩粜月.%包括特异探针大肠埃定量粜晕粜月%,而脑脊液培养阳性例只为差异具有统计学意义。蟪ΠO>秸胙粜份,表皮葡萄球菌探针阳性荩秸胙粜份,探针阳性荩酒咏谎粜月饰%;而份脑脊液培养阳性标本·份肺炎克雷伯氏菌培养阳性,荽蟪ΠO>粜裕嘌粜月饰%/煌∏榛曰级约挂航砥胂妇鶧的拷贝数、值存在差异,重型患儿鶩狿的值明显低于轻型患儿,值越高,其∠妇奖词降停琧涤隓拷贝数两者之问呈负剌关关系。份—粜缘哪约挂憾云洳≡鶧的锊庑颍峁。,,符合细菌培养大肠埃希菌阳性的报告;另。例值为血培养刚性份,阳性率为/,前存‘明显高于后青,差异具有显著意义軫狿阳性标本进一步基冈芯片杂交,结果通』探针均阳性。其一探针阳性份ㄌ匾焯秸敕窝琢辞蚓份、表皮葡萄球菌阳性荨⒔黄色葡萄球菌阳性荨,秸胙粜希菌阳性荨⒘鞲惺妊8司鷏份菅E嘌粜员瓯酒涠杂Φ墓恳蛐酒交结果,狦秸胙粜怨荩珿。探针阳性荩揖苡胂嘤Φ奶匾焯秸敕⑸浙江大学硕上学位论文。‘
结论:关键词:槐┮蛐酒挥ü舛縋;化脓性脑膜炎:败血症杂交,其杂交的探针菌株与血培养细菌阳性结果基本相符。其·份血培养阳性的标本其基因芯片上没有设计到其相应的较稀少的特异探针,但其通用探针,相应的、L秸刖粜浴F渲醒E嘌D癯η蚓粜缘标本,其基因芯片上通,日探针和探针均阳性;血培养分别为少动鞘氨醇单胞菌和洋葱伯克霍尔德菌的其基因芯片上通刻秸牒虶。探针均阳性。份血培养荧光定量粜缘谋瓯酒浣右蛐酒咏唤峁胙R号嘌峁尽R与牡冈:占片杂交技术二崭的阳性检出率均高于常规血培养法,说明该项技术较血交以确定并区分细菌的类型,,其脑脊液培养及芯片杂交示