文档介绍：新疆医科大学
硕士学位论文
shRNA干扰食管癌Eca109细胞ERK2表达的实验研究
姓名:霍奇
申请学位级别:硕士
专业:病理学与病理生理学
指导教师:卢晓梅
2010-04
摘要
shRNA 干扰食管癌 Eca109 细胞 ERK2 表达的实验研究
研究生:霍奇导师:卢晓梅教授

摘要
目的:构建针对细胞外信号调节激酶 2(Extracellular Signal- regulated Kinase2,
ERK2)基因短发夹式 RNA(shRNA)及其表达载体,转染人食管癌细胞 Eca109,观察
其对食管癌细胞 Eca109 中 ERK2 基因沉默效果和增殖的影响及其可能的作用机制。
方法:利用 Western-blot 方法检测含 10%胎牛血清培养液刺激和 ERK2 抑制剂
U0126(10μM-50μM)对食管癌细胞 Eca109 的 p-ERK2 表达的影响。在 Genebank 中筛
选 ERK2 基因 siRNA 干扰的靶向序列,设计并合成含有发夹结构的 60 个碱基序列的
寡核苷酸链,寡核苷酸链退火后用 T4DNA 连接酶连接到 pGeneClipTM 载体上,构建
重组质粒(简写为 shRNA- ERK2),并对重组质粒进行酶切和测序鉴定。利用核酸
转染试剂 Lipofectamie 2000 转染食管癌细胞 Eca109,荧光倒置显微镜和四甲基偶氮
唑蓝比色试验(MTT 法)分别观察转染 24h、48h、72h、96h 的转染效率和细胞增殖活
力。将食管癌细胞 Eca109 分为转染 ERK2 靶向序列实验组、非特异序列组、脂质体
组及抑制剂 U0126 对照组,采用 Western-blot 检测转染重组质粒 72h 和 96h 的 ERK2
蛋白和 Survivin 蛋白的表达情况;利用流式细胞仪技术测定转染重组质粒 96h 细胞
凋亡和细胞周期分布情况。结果: 1. 含 10%胎牛血清培养液刺激食管癌细胞 p-ERK2
的表达随时间的延长逐渐增加;随着 U0126 浓度的增加使 p-ERK2 的表达逐渐降低。
Pst1 酶切和 DNA 测序分析后,提示 ERK2 靶向 RNA 干扰重组载体构建成功。
24h 细胞开始出现绿色荧光表达,以后随着时间
延长绿色荧光表达逐渐增多,72h 绿色荧光表达最多,96h 略下降。检测转染
靶向 ERK2 实验组对食管癌细胞 Eca109 增殖的抑制率随着时间延长逐渐升高,96h
对食管癌细胞增殖的抑制率最高(%),与非特异序列组和空白对照组比较差
异显著(P<),非特异序列组和空白对照组之间差异无显著性(P>)。5.
转染靶向 ERK2 干扰 72h 和 96h 实验组对 ERK2 蛋白和 survivin 蛋白表达的影响与对
照组相比差异显著(P<)。 96h 细胞凋亡率为
%,细胞周期阻滞在 G1 期。结论: 蛋白的表达与食管癌细胞 Eca109 的发
生发展相关。 ERK2 靶基因的重组质粒成功构建和体外成功转染食管癌细胞
Eca109,可抑制该基因的表达和细胞生长。可以通过抑制 Survivin 蛋白的
表达影响食管癌细胞 Eca109 的生长。 Eca109 生长可
能有诱导细胞凋亡和影响细胞周期进程两种机制参与。提示质粒介导的 RNA 干扰技
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新疆医科大学医学硕士学位论文
术有望成为治疗食管癌细胞的一种新的手段,为食管癌的基因治疗提供了一条新的
思路。

关键词:shRNA;Eca109;ERK2;survivin;细胞增殖

The study on ERK2 expression in esophageal cancer 109
cell line by short hairpin RNA interference
Postgraduate:Qi Huo Supervisor: Lu

Abstract
Objective: Short hairpin RNA (shRNA) interference vector targeted ERK2 was
constructed using pGeneclip U1 hairpin cloning systems,to observe ERK2 gene silencing
effect and mechanisms