文档介绍：山东农业大学
硕士学位论文
黄伞子实体多糖的分离纯化、结构鉴定及生物活性的研究
姓名:聂永心
申请学位级别:硕士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:温孚江;朱常香
2011-06-05
山东农业大学博士论文
中文摘要
黄伞(Pholiota adipose (Fr.) Quel),又名柳蘑、黄蘑、多脂鳞伞,属于层菌纲,伞
菌目,球盖菇科,鳞伞属,是一种具备较高研究开发价值的食药用真菌。黄伞子实体不
仅菇质脆嫩,味道鲜美,营养丰富,而且其多糖具有调节机体免疫力、抗肿瘤、降血脂、
抗菌、抗氧化、抗衰老等多方面的生物活性。目前为止,关于黄伞的研究大多集中在多
糖提取工艺和粗多糖活性分析等方面,对黄伞子实体多糖的纯化、结构和纯化多糖级分
活性的研究还未见有报道。本研究以黄伞子实体为试材,对其多糖的分离纯化、结构鉴
定及体外抗氧化活性等方面进行了较系统的研究,对开发利用我国珍贵的药用真菌资源
具有重要的学术意义,对开发天然抗氧化剂也具有一定的实用价值。研究结果如下:
1. 黄伞子实体多糖提取工艺研究
通过单因素试验和正交试验,确定了水提醇沉法提取黄伞子实体多糖较佳的提取工
艺,提取温度为100℃,时间4h,水料比为20:1v/w,浸提次数1次,此工艺下黄伞子实体
%。
2. 黄伞子实体多糖分离纯化研究
黄伞子实体多糖通过脱蛋白、脱色、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析和
superdexTM 200凝胶柱层析分离纯化,得到3个黄伞子实体多糖组分(PAP1-1、PAP1-2和
PAP2-1),经紫外扫描和HPSEC分析,3种多糖组分为基本不含蛋白和核酸的均一组分,
%、%%。
3. 多糖单糖组成检测方法的建立
(1)糖腈乙酰酯衍生化气相色谱法
色谱条件:DB-23石英毛细管柱(30m×× ),FID检测器,检测器温
度250℃,进样口温度250℃,柱温220℃;,,分流比20:1,
在20min内实现了8种单糖的分离;
(2)非衍生化HPLC-ELSD法
色谱条件:Prevail Carbohydrate ES Column(×250mm, 5µm),柱温25℃;流
动相为乙腈-水(85:15),;ELSD检测器温度80℃,辅助气(N2)压力
,增益(gain)为6,在35min中内实现了葡萄糖醛酸和6种单糖的分离。
4. 黄伞子实体均一多糖组分的结构分析
通过HPSEC、GC、HPLC-ELSD、IR和NMR(1H NMR和13C NMR)等方法,初步
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黄伞子实体多糖的分离纯化、结构鉴定及生物活性的研究
鉴定了黄伞子实体均一多糖的化学结构。
(1)PAP1-×106Da,由α-D吡喃葡萄糖残基组成的葡聚糖,基本不
含糖醛酸,多糖主链由1-4和1-6糖苷键连接;
(2)PAP1-2 分子量约为 ×103Da,由 D-吡喃葡萄糖和鼠李糖组成,摩尔比为
:1,基本不含糖醛酸,可能同时含有α和β型糖苷键,主链由 1-6 糖苷键连接;
(3)PAP2-×106Da,由α-D吡喃葡萄糖残基组成的葡聚糖,基本不
含糖醛酸,多糖主链由1-4和1-6糖苷键连接。
5. 黄伞子实体多糖的生物活性分析
(1)通过观察提取纯化的黄伞子实体多糖(PAP)对小鼠腹腔巨噬细胞的(PEMΦ)
激活效应,结果表明黄伞子实体多糖能有效地激活巨噬细胞,通过增强细胞因 IL-1β子
分泌、增强 NO 的产生水平、增强其吞噬功能及体外杀伤活性等多种途经来调节免疫系
统,并可起到抑制肿瘤的生长的效应;
(2)黄伞子实体多糖(PAP)灌胃给药,对小鼠 S180 实体瘤有一定的抑瘤作用,
且呈现剂量效应关系,灌胃剂量为 ·d 时,抑瘤率为 %;
(3)通过密闭缺氧实验发现不同剂量的黄伞子实体多糖(PAP)均能不同程度地延
长小鼠在密闭条件下的存活时间,其中以 ·d 效果最好,存活时间比对照组延长
了 %;
(4)通过检测PAP、PAP1-1、PAP1-2和PAP2-1对DPPH自由基、超氧阴离子自由
基和羟基自由基的清除能力,对黄伞子实体多糖的体外抗氧化活性进行了研究,并与阳
性对照抗坏血酸(Vc)进行比较。结果表明,PAP对三种自由基都表现出了一定的清楚
能力,而且清除DPPH自由基的能力高于