文档介绍：转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究与药物研发领域不可或缺得重要技术,该技术从上世纪七八十年代诞生以来,已有近四十年得历史,经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰,并逐渐从基础研究实验室转向商业模式,成为一项高度标准化得新兴产业 一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究与药物研发领域不可或缺得重要技术,该技术从上世纪七八十年代诞生以来,至今已有近四十年得历史,经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰,在小鼠模型构建方面日趋完善,并且如同剪切酶与抗体等常规分子生物学试剂得制备技术一样,逐渐从基础研究实验室转向商业模式,成为一项高度标准化得新兴产业,催生了数以百计得创新药物与数以千计得优秀文章。尽管如此,传统技术仍然存在一些难以克服得缺陷,如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等,而ZFN与TALEN等新技术得出现,、同源重组技术原理基因敲除鼠技术就是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组得原理发展起来得,hi与Smithies在1987年根据同源重组(homologous rebination)得原理,首次实现了ES得外源基因得定点整合(targetedintegration),这一技术称为”基因打靶”(gene targeting)或"基因敲除"(geneknockout),利用这种ES得显微注射就可以制作出基因敲出小鼠(KOMice:knockoutmice);由于这一工作,hi与Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。同源重组(homologousrebination)定义:就是指发生在姐妹染色单体(sister chromatin)之间或同一染色体上含有同源序列得DNA分子之间或分子之内得重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中,需要针对目得基因两端特异性片段设计带有相同片段得重组载体,将重组载体导入到胚胎干细胞后外源得重组载体与胚胎干细胞中相同得片段会发生同源重组,如图1所示:图1、基因敲除鼠制作同源重组原理示意图三、制作流程图2、基因敲除鼠制作过程示意图1、 Knockout载体设计与构建根据研究项目具体情况与要求把目得基因与与细胞内靶基因特异片段同源得DNA 片段都重组到带有标记基因(如neo基因,TK 基因等)得载体上,成为重组得Knockout载体。2、KnockoutES细胞筛选Knockout载体测序验证正确后,将载体线性化,然后电转入ES细胞,通过载体上得正负筛选基因获得阳性得KnockoutES克隆。选取PCR鉴定打靶载体正确插入得ES基因组DNA用于SouthernBlot鉴定,将Southern Blot鉴定得Knockout ES扩大培养并液氮保存。3、KnockoutES细胞囊胚注射得到嵌合体小鼠扩增经鉴定插入或置换片段位置正确得KnockoutES细胞,以囊胚显微注射得方式将一定数量得KnockoutES细胞注入特定品系小鼠囊胚中,然后将囊胚移植到假孕得小鼠子宫中。待后代小鼠出生后,通过小鼠得毛色中来源于ES细胞毛色得比例判断嵌合程度得高低,以及该小鼠得后代中可能获得生殖系传递能力。4、由嵌合体小鼠繁殖出生殖遗传系Knockout小鼠将嵌合体小鼠与适当品