文档介绍：GE Healthcare
Life Sciences
Application Note IN Cell Analyzer 2000
成像细胞分析技术用于人干细胞来源
的心肌细胞的开发及验证
前言样本
近几年出现已确认可以安全使用的药物因为毒性问题被心肌细胞(GE Healthcare)
召回的案例,其中大多数是因为发现药物有心脏毒性问免疫染色
题。为了避免此类问题,在药物开发阶段,需要进行有生
将心肌细胞接种于Matrigel包被的的微孔板中,37℃培养
理学意义的毒性试验,即使用心肌细胞进行模拟实验。
48小时,培养过程中隔天换培养基。通常培养3~6天以
GE Healthcare成功开发出人胚胎干细胞(hES)源心肌
后,将细胞用2%多聚甲醛固定,用5%血清/1%人IgG,
细胞,可以按工业规模提供这样的细胞。为了对hES源心
2~8℃封闭20分钟。免疫染色时,一抗,2~8℃,1小
肌细胞进行相关评价,采用不同方法验证了hES源心肌细
时,二抗,2~8℃,1小时,然后进行清洗。细胞核用
胞的核型、离子通道功能、重要心脏标志的表达等(1,
Hoechst 33342染色。
2)。本研究中,使用高内涵细胞分析技术评价心肌细胞
的特性,并用抗心律不齐药胺碘酮进行了多元毒性试验。
毒性试验
实验内容将心肌细胞接种于Matrigel包被的μClear微孔板中,
37℃培养48小时,换培养基时添加化合物,继续培养24
使用的产品小时。用Hoechst 33342、Fluo-4AM、Mitotracker Red
IN Cell Analyzer 2000 CMXRos、及TOTO-3 iodide进行细胞染色,37℃孵育1小
IN Cell Investigator Software 时后,拍照并做图像分析。
图像获取
选择40倍( NA)物镜,使用IN Cell Analyzer 2000 拍
摄活细胞图像。固定细胞的图像,采用2倍、20倍或上述
40×( NA)物镜,D相机拍
摄。图像用IN Cell Investigator软件进行分析。
71-3406-11
结果与讨论
高内涵分析技术分析心肌细胞的性质结果表明每孔平均40,000多个细胞的接种密度是最佳密度
(图3、图5B),因此本研究中,其后的细胞表征及毒性
优化细胞接种密度很重要,决定心肌细胞是否在最佳条件
试验使用每孔平均40,000个细胞的接种密度。
下生长和成熟。使用IN Cell Analyzer 2000的预览扫描功
能,对微孔板进行整板的预览成像,确认细胞状态(图
1)。
图1. 在实验前,通过预览扫描优化心肌细胞接种密度。
96 孔板,每孔接种80,000~2,500个细胞(A);384孔板,每孔接种图3:接种密度优化的图像分析
25,600~800个细胞(B)。固定细胞,用Hoechst33342染色,通过IN 以每孔平均80,000~2,500个细胞的密度接种心肌细胞到96孔板中。使
Cell Analyzer 2000预览扫描获得全部孔的图像。 D相机IN CellAnalyzer 2000获得全孔图像,用IN
Cell Inve