文档介绍：:..免疫荧光双标记在心肌石蜡切片中的应用陈绪军肖明第吕志前卢成宝薛松袁忠祥徐根兴作者单位:200080上海市第一人民医院心血管外科细胞性心肌塑型术(cellularcardiomyoplasty)用于缺血性心肌病的治疗受到人们越來越多的关注⑴,在证实移植的人干细胞在缺血/损伤的环境屮分化为人心肌细胞方面,免疫荧光技术的运用逐渐增多,但多用的是新鲜冰冻切片,在石蜡心肌切片中应用较少,而且多是单一抗原的荧光标记⑶。有研究表明,酪***信号放大(tyramidesignalamplifications,TSA)技术可以提高反应的灵敏性⑷。为此,我们以人心肌石蜡切片标本为例,运用TSA—免疫荧光法与常规I'可接免疫荧光法分别对人心肌连接蛋白(connexin-43,Cx-43)蛋白及肌凝蛋白(myosin)进行标记,旨在为心肌石蜡切片建立一个免疫荧光双标记的方法。一、 :兔抗人肌凝蛋白(myosin)多克隆IgG抗体购自美国Chemicon公司,标记界硫鼠酸酯荧光素(FITC)的驴抗兔多克降IgG抗体与标记有辣根过氧化物酶(HRP)的驴抗小鼠多克隆TgG抗体均购自美国JacksonImmunity公司,小鼠抗人Cx-43单克隆抗体、碘化丙®(PI)与牛血清白蛋白(BSA)购自美国Sigma公司,酪***(tyramide)-coumrian结合物试剂盒购自美国PerkinElmer公司。、固定、切片及抗原修复:人心肌取自一例6岁先天性心脏病小孩右房耳,中***尔马林固定,4°C过夜固定,梯度酒精脱水,石蜡包埋,5 石蜡切片。石蜡切片常规脱蜡、梯度酒精浸泡后行抗原修复:()中,95°C,浸泡30min,室温冷却10min。-43的免疫荧光标记:采用TSA-免疫荧光法⑷,按试剂盒说明书进行。磷酸盐缓冲液(PBS)室温洗涤2次,每次5min。置入3%过氧化氢/甲醇溶液屮,室温,孵育10min。再室温PBS洗涤3次,每次5mino3%的BSA室温孵育30min。加入小鼠抗人Cx-43单克隆IgG抗体,4°C孵育过夜。TnT缓冲液(-HCl,,,%吐温-20)室温洗涤3次,每次5mino加入标记有HRP的驴抗小鼠IgG抗体,室温孵育1hoTnT液室温洗涤3次,每次5min。配制酪***-coumrian工作液:将酪氨-coumrian结合物加入放大缓冲液中配成酪***-coumrian工作液(1:50),避光,室温孵育15min。再次TnT液洗涤3次。:接上一步。釆用间接免疫荧光法⑸。兔抗人肌凝蛋白多克隆IgG抗体(1:20), 37°C孵育1h,PBS洗涤3次。加入标记FITC的驴抗兔多克隆TgG抗体(1:100),避光,室温孵育1hoPBS室温洗涤3次,每次5min。:加入碘化丙唳(PI/PBS,1ug/ml),室温避光孵育3minoPBS室温洗涤3次后甘油封片。:运用带有3通道的AX-80型Olympus荧光显微镜镜检:绿通道中观察FITC信号;蓝通道中观察coumri