文档介绍：华中科技大学
硕士学位论文
香菇多糖LT1的提取纯化及结构鉴定
姓名:辜明
申请学位级别:硕士
专业:药剂学
指导教师:张玉;王凯平
20090501
摘要
香菇多糖是香菇中最重要的一类生物活性物质,作为一种免疫促进剂,在 20
世纪 60 年代已引起人们广泛的研究兴趣。现代研究表明:香菇多糖具有抗病毒、
抗肿瘤,调节免疫力、降血糖及抗氧化等功能。LT1 是本实验室从香菇子实体中
提取得到的一种单一分子量多糖,经结构研究发现 LT1 是一种未报道的新型香菇
多糖,其分子量 Mw=642 kDa,经检验符合国家香菇多糖注射剂原料药的质量标
准的要求。本论文对 LT1 的提取分离方法、化学结构和糖链构象进行了较为系统
的研究,内容主要包括香菇多糖 LT1 的分离纯化、LT1 的质量控制研究、LT1 的
化学结构研究和糖链构象研究四部分。
第一部分香菇多糖 LT1 提取纯化研究
对香菇多糖的提取纯化工艺进行研究,改进了传统的提取纯化方法,以更少
的有机试剂以及纯化步骤提取出香菇多糖 LT1,经高效液相色谱证实 LT1 为一种
单一分子量多糖,其分子量 Mw=642 kDa。Molish 实验说明 LT1 为糖类物质,
KI-I2 实验表明 LT1 不是淀粉类物质。
第二部分香菇多糖 LT1 的质量控制研究
依据国家香菇多糖注射剂原料药质量标准 WS1-320(X-263)-2004Z,对香菇
多糖 LT1 进行质量控制研究。采用傅立叶红外光谱、紫外分光光度计、高效液
相色谱等方法,考察 LT1 的光谱特征、糖含量、糖链特征等物理化学性质。傅
立叶红外光谱分析结果表明香菇多糖 LT1 中含有 a、ß构型单糖;经硫酸-苯酚法
测得 LT1 的糖含量达到 %(以葡萄糖计);表征糖链特征的高碘酸氧化实验
测得氧化前后的吸光度之差为 。以上测试结果均符合国家质量标准
WS1-320(X-263)-2004Z 的要求,说明香菇多糖 LT1 符合国家香菇多糖注射剂原
料药的要求。
第三部分香菇多糖 LT1 的化学结构研究
对香菇多糖 LT1 的化学结构进行研究。毛细管粘度法测定香菇多糖 LT1 的
1
粘度性质。粘度分析结果显示,LT1 显示与一般高分子化合物不同的粘度性质,
其比浓粘度和增比粘度均随浓度增加而减小。综合运用气相色谱-质谱联用技术、
傅立叶红外光谱、糖类甲基化分析、高碘酸氧化实验、Smith降解实验、核磁共
振波谱等方法,考察 LT1 的光谱特征、单糖组成和糖链连接等化学结构性质。
单糖组成 GC 分析结果表明香菇多糖 LT1 仅由 D-glucose 组成;傅立叶红外光谱
显示 LT1 为典型的多糖类物质,含有 a 和ß构型两种 D-glucose;高碘酸氧化和
Smith 降解表明 LT1 含有 1-3,1-4,1-6 连接的糖残基;甲基化实验证明了上述
结果,从甲基化实验 GC 图谱上可知:还原末端,1-3 连接糖残基,1-4 连接糖
残基和 1-4-6 连接糖残基的分子比例约为 1:1:2:;由于 LT1 分子量较大,
水溶性较差,故对其部分酸水解产物进行核磁共振实验(1H、13C、DQF-COSY、
HSQC、HMBC), 结合上述化学以及波谱学实验,可以推测 LT1 分子可能为如
下结构:
或
由以上结构可知,香菇多糖 LT1 是一种从香菇子实体中提取出的新型单一分
子量多糖。
第四部分香菇多糖 LT1 的糖链构象研究
相关研究表明,多糖的药理活性与其糖链的三螺旋结构有密切联系。多糖在
不同溶液中其分子会呈现不同的构象,同时多糖分子的构象改变往往伴随着一些
理化参数如旋光度等的变化。通过测定 LT1 在不同浓度 NaOH 溶液中的旋光度
和刚果红实验证明,LT1 分子在 NaOH 中以三螺旋结构存在,在 NaOH 浓
度大于 时可能会发生构象的转变。从 LT1 的原子力显微镜(AFM)图谱
2
中可以发现 LT1 分子在水溶液中存在着线性和分支结构,经过测量其厚度为
左右,与文献报道的多糖三螺旋糖链的厚度相似。可以由此推断 LT1 分
子在水溶液中由三条糖链螺旋组成,并在此基础上形成线性或分支结构。
综上所述,从香菇子实体中提取的多糖 LT1 达到高效液相色谱纯,由 a 构
型和ß构型吡喃葡萄糖组成。其化学结构可能为:以 1, 4 连接的 a 构型吡喃葡萄
糖和 1, 3 连接的ß构型吡喃葡萄糖构成其主链,主链中 1, 4 连接的葡萄糖 C6 位
上含有支点(每 4