文档介绍：第三军医大学
博士学位论文
大劣按蚊抗约氏疟原虫感染相关蛋白的研究
姓名:王英
申请学位级别:博士
专业:病原生物学
指导教师:黄复生
20061101
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大劣按蚊抗约氏疟原虫感染相关蛋白的研究摘要疟疾目前仍是严重危害人类健康的一种寄生虫病,每年导致万人死亡。近年来,疟原虫抗药性和蚊媒耐药性的产生和迅速扩散,加之有效疟疾疫苗的缺乏,给疟疾防治工作带来很大的困难。传统方法已难于控制该病的流行,迫切需要为疟疾的防治工作提供新的方法和治疗靶点。通过对疟原虫在蚊体内发育过程中关键环节的干扰来阻断疟疾的传播,是控制疟疾的一类有价值的新策略。而这一策略的实施需要对蚊与疟原虫之间的复杂关系有着比较详细的了解,尤其是蚊抗疟原虫感染和疟原虫在蚊体内发育所需的一些关键分子的鉴定至关重要。抗菌肽的产生、细胞吞噬作用和黑化包被反应是蚊抗疟原虫感染中最为重要的三类免疫反应,对其相关分子的鉴定具有重要意义。其中,黑化包被反应是按蚊的一种有效的抗疟机制,反应的某些关键成分缢堪彼岬鞍酌来源于血淋巴。目前关于蚊抗疟原虫感染分子机制的研究主要集中于冈比亚按蚊,对大劣按蚊的研究甚少。大劣按蚊是我国及东南亚地区的主要传疟媒介,能够通过卵囊黑化包被的方式杀伤其体内的约氏疟原虫,从而阻断对该疟原虫的传播。因此,,利用该模型可以开展疟疾蚊媒阻断策略及医学昆虫免疫的相关研究。本研究即是利用二维电泳⒃吮泶铩、、实时荧光定量.、免疫组化、激光共聚焦等技术对大劣按蚊血淋巴中抗约氏疟原虫感染相关蛋白进行分离、鉴定,并对丝氨酸蛋白酶进行相关研究。整个研究分为三大部分:第一部分:筛选和鉴定大劣按蚊感染约氏疟原虫后血淋巴相关蛋白,并对该相关蛋白的生物学作用进行分析。⒗技术较好地分离了感染约氏疟原虫前后的血淋巴蛋白,比对后获得个差异蛋白点。⒍愿腥厩昂蟮牟糠植钜斓鞍兄势追治觯⒍訢蠳端氨基酸测序,根据检测结果在蛋白质数据库中进行检索、分析和生物学特性的预测。结果显示,~I形扪芯康奈粗5鞍祝渲蠨赡茉谖每古痹娓腥局衅着重要作用。第二部分:对大劣按蚊丝氨酸蛋白酶进行原核表达,并检测表达产物与烟草天蛾前酚氧化酶活化酶寡G逯涞拿庖叻从π裕苯猩镄畔⒀Х析,以明确利用烟草天蛾寡G逖芯看罅影次盟堪彼岬鞍酌傅目尚行浴K嬷第三军医大学博士学位论文
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蛋白酶进行生物信息学分析显示,大劣按蚊丝氨酸蛋白酶与烟草天蛾涞陌被用烟草天蛾固澹缘缬痉掷氲难A馨偷鞍捉辛思ê陀肱痹娓腥镜南喙匦研究。⒊晒菇舜罅影次盟堪彼岬鞍酌窹疉表达质粒,并在大肠杆菌中进行原核表达,表达获得了一笮〉娜诤系鞍住检测结果显示,烟草天蛾寡G逵氪罅影次盟堪彼岬鞍酌妇哂忻庖叻从π浴6岳コ嫠堪彼酸序列有较高同源性,且关键位点保守。本研究提示,利用烟草天蛾寡G迨侗大劣按蚊丝氨酸蛋白酶可行。⒗醚滩萏於關抗血清,结合甈和技术,对大劣按蚊感染约氏疟原虫前后血淋巴中的丝氨酸蛋白酶进行分离、识别和鉴定。结果显示,在大劣按蚊血淋巴蛋白中有分子量不同的两个蛋白能与寡G宸从Γ腋腥前后的差异提示该蛋白可能与疟原虫的感染相关。第三部分:从水平和蛋白水平分别对大劣按蚊丝氨酸蛋白酶进行组织定位和定量研究。⒗肦蚏畉际醮觤蕉运堪彼岬鞍酌冈谖锰迥诮行组织定位和定量研究。结果显示,血淋巴细胞和唾液腺中有丝氨酸蛋白酶表达,而蚊胃中则难以确定有无该酶的表达;感染前后及吸血后的不同时相点丝氨酸蛋白酶淖B妓讲煌浔浠赡苡肱痹娴母腥居泄亍⒋拥鞍姿嚼妹庖咦榛际鹾图す夤簿劢辜际酰范ㄋ堪彼岬鞍酌冈诖罅影蚊不同组织中的分布及在感染前后不同时相点的蛋白含量。结果显示,在血淋巴细胞、唾液腺和蚊胃中均有丝氨酸蛋白酶的蛋白分布;其含量于吸血后不同组及不同时相点有所不同,不同组间丝氨酸蛋白酶的蛋白水平变化提示该酶与疟原虫卵囊黑化包被反应相关。本研究旨在寻找大劣按蚊抗约氏疟原虫感染相关蛋白,并明确丝氨酸蛋白酶是否疟原虫感染相关蛋白,分析该酶在蚊抗疟原虫感染中的作用。结果显示,大劣按蚊丝氨酸蛋白酶可能参与了蚊抗疟原虫感染的卵囊黑化包被反应。这将为认识疟原虫和蚊媒的相互关系及进一步明确卵囊黑化机制、探索疟原虫防治新策略奠定试验和理论基础。关键词:大劣按蚊;约氏疟原虫;血淋巴;差异表达蛋白;丝氨酸蛋白酶;黑化包被反应;二维电泳;实时荧光定量幻庖咦榛患す夤簿劢第三军医大学博士学位论文
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