文档介绍：流感病毒快速检测方法一、 RT-PCR快速诊疗方法(一) 生物安全要求(二) 病毒核酸提取(三) RT-PCR(四) PCR产物纯化(五) 流感病毒RT-PCR检测引物二、 免疫荧光方法检测流感病毒(一) 原理(二) 标本处理(三) 间接免疫荧光法(四) 结果判定三、 实时荧光定量PCR(Real-TimePCR)快速诊疗检测(一) 基础原理(二) 试验试剂(三) 试验步骤四、 快速诊疗试剂盒流感快速检测方法,和传统病毒分离判定相比含有快速、简便特点。所以常见于流感暴发时早期病原学检测用。流感快速诊疗包含直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-TimePCR快速诊疗速方法、流感快速诊疗试剂盒等。这里介绍RT-PCR、Real-TimePCR、免疫荧光快速诊疗速诊疗方法和多个流感快速诊疗试剂盒优缺点。不管那种快速诊疗全部无法替换传统病毒分离判定方法。RT-PCR快速诊疗方法核酸检测是一个判定流感病毒基因组有力方法,即使基因组含量很低或死病毒也能够检测到。本章将介绍检测流感病毒聚合酶链式反应(PCR)。流感病毒基因组是负链RNA,在进行PCR扩增前必需合成和病毒RNA互补DNA,即为cDNA。逆转录酶(RT)就是用于合成cDNA多聚酶,所以,扩增流感病毒基因组过程称为RT-PCR。RT-PCR需要一对型别特异引物,四种脱氧核苷酸(dNTPs),RNA模板,逆转录酶及TaqDNA多聚酶;首先由逆转录酶将病毒RNA逆转录合成cDNA,然后再进行聚合酶链反应经25~30个循环,使DNA产物达成倍增效果。生物安全要求生物安全等级和个人防护要求:生物安全二级试验室,防护要求和二级试验室要求相同。并应遵守对应生物安全要求。进行高致病性禽H5RT-PCR快速检测时能够在生物安全二级试验室里进行,核酸提取在生物安全三级试验室生物安全柜里完成。病毒核酸提取试验材料及仪器QIAGEN企业RneasyMiniKit(Catalog#74104)β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)70%、20μl、200μl、1000μl加样器和枪头可调14K微型离心机旋转混合器操作步骤取1支无菌、,加入500μlRLT。取采样液(鼻拭子、咽拭子、胸水等)或病毒培养物(鸡胚尿囊液或细胞培养液)100μl,加入上述Eppendorf管中。加5μlβ-巯基乙醇,充足混匀。加600μl70%乙醇,于旋转混合器混匀。从试剂盒中取出带滤膜离心柱,并标上标本号。将第4步混合液体分两次(每次600μl)吸入于滤柱中,1rpm离心15秒,弃搜集管中离心液。滤柱仍放回搜集管上,将第4步混合液全部吸入滤柱中,1rpm离心15秒,弃搜集管中液体。于滤柱中加入700μlRW1,1rpm离心15秒。从试剂盒中取出一支新2ml搜集管,将离心后滤柱转到新搜集管上,于柱子中加入500μlRPE,1rpm离心15秒弃搜集管中液体。滤柱放回搜集管上,于滤柱中加入500μlRPE,13000~14000rpm离心2分钟。,,于滤柱中加入30~50μl无RNA酶水,室温静置1~3分钟。1rpm离心1分钟,弃滤柱。搜集离心液即为提取病毒RNA,能够直接用于逆转录试验,或在-20℃以下保留,-30℃可保留3~4个月。注意事项试剂盒中RPE液用前需加44ml无水乙醇,使终体积达成55ml。全部用过枪头、搜集管放入2%次***酸钠消毒缸中过夜。RT-PCR一步法RT-PCR试验材料QIAGENOneStepRT-PCRKitCatNo210212RNaseinhibitor40u/μl(Promega)上游引物200ng/μl下游引物200ng/μl模板RNA(TempletRNA)试验步骤PCR反应配置(在清洁区缓冲间,加RNA模板应在核酸室)无RNA酶水(RnaseFreeWater)×:50μl将PCR反应管放入PCR扩增仪RT-PCR反应条件:此循环反应条件仅共参考,假如引物更换,对应反应条件需要做合适调整。60℃1min42℃10min50℃30min95℃15min94℃30sec52℃30sec72℃1min返回第5部,循环34次72℃10min4℃保留PCR产物检测琼脂糖凝胶配置:用1×%~%溶液,加热使之完全溶解。冷却到50~60℃时加入溴化乙锭(EthidiumBromideEB,10ug/μl),。PCR