文档介绍：流感病毒的快速检测方法— RT-PCR丿快速诊断方法(-)生物安全要求(-)病毒核酸提取(三) RT-PCR(四) PCR产物纯化(五) 流感病毒RT-PCR检测引物 免疫荧光方法检测流感病毒(-)原理(-)标本处理(三) 间接免疫荧光法(四) 结果判断 实时荧光定量PCR(Real-TimePCR)快速诊断检测(-)基本原理(二) 实验试剂(三) 实验步骤 快速诊断试剂盒流感的快速检测方法,与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。因此常见于流感暴发时早期病原学检测用。、RT--TimePCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。这里介绍RT--TimePCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。一、RT-PCR快速诊断方法核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法,即使基因组含量很低或死病毒也能够检测到。本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应(PCR)o流感病毒的基因组杲负链RNA,在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA互补的DNA,即为cDNAo逆转录酶(RT)就是用于合成cDNA的多聚酶,因此,扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCRORT-PCR需要一对型别特异引物,四种脱氧核昔酸(dNTPs),RNA模板,逆转录酶及TaqDNA多聚酶;首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA,然后再进行聚合酶链反应经25一30个循环,使DNA产物达到倍增的效果。生物安全要求生物安全级别与个人防护要求:生物安全二级实验室,防护要求与二级实验室的要求相同。并应遵守相应的生物安全规定。进行高致病性禽H5RT-PCR快速检测时能够在生物安全二级实验室里进行,核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。病毒核酸提取实验材料及仪器QIAGEN公司的RneasyMiniKit(Catalog#74104)卩-疏基乙醇(p-mercaptoethanol)70%"、200|11、1000H1加样器和枪头可调14K微型离心机⑺旋转混合器操作步骤取1支无菌、(、胸水等)或病毒培养物(鸡胚尿/液或细胞培养液)100山,加入上述Eppendorf管中。加5卩1卜铳基乙醇,充分混匀。⑷加600卩170%乙醇,于旋转混合器混匀。(5)从试剂盒中取出带滤膜的离心柱,并标上标本号。(6)将第4步的混合液体分两次(每次600卩1)吸入于滤柱中,1rpm离心15秒,弃收集管中的离心液。⑺滤柱仍放回收集管上,将第4步的混合液全部吸入滤柱中,1rpm离心15秒,弃收集管中液体。于滤柱中加入700glRW1,1ipm离心15秒。从试剂盒中取出一支新的2ml收集管,将离心后的滤柱转到新的收集管上,于柱子中加入500卩1RPE,1ipm离心15秒弃收集管中液体。滤柱放回收集管上,于滤柱中加入500nlRPE,13000-14000rpm离心2分钟。,,室温静置1一3分钟。1rpm离心1分钟,弃滤柱。收集的离心液即为提取病毒的RNA,能够直接用于逆转录实验,或在-20°C以下保存,・30°C可保存3一4个月。3•注意事项试剂盒中的RPE液用前需加44ml无水乙醇,使终体积达到55mlo所有用过的枪头、收集管放入2%次氯酸钠消毒缸中过夜。RT-PCR—步法RT-PCR实验材料QIAGENOneStepRT-PCRKitCatNo210212RNaseiiiliibitor40u/|.il(Promega)上游引物 200ng/nl下游引物 200ng/|.il模板RNA(TempletRNA)实验步骤PCR反应配置(在清洁区缓冲间,加RNA模板应在核酸室)无RNA酶水(RiiaseFreeWater) 10 pllOmMdNTP 2glEnzymeMix 2卩1Riiaseiiiliibitor |il上游引物 IM下游引物 1山RNA模板 5卩1总量:50)11将PCR反应管放入PCR扩增仪RT-PCR反应条件:此循环的反应条件仅共参考,如果引物更换,相应的反应条件需要做适当调整。T60°C1minT42°C10minT50°C30minT95°C15min—>94°C30sect52°C 30sec->72°C 1min-返回第5部,循环34次t72°C 10mint4°C 保存PCR产物检测琼脂糖凝胶配置:%—%溶