文档介绍：超薄切片技术
河北大学细胞生物学
由于电镜电子束穿透能力的限制,,这种薄片称为超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。
在透射电镜的样品制备方法中,超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似,需要经过取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步骤。
超薄切片主要步骤
取材、分割
固定
脱水
渗透、包埋
超薄切片
超薄切片染色
1 取材、分割
取材、分割的基本要求
    组织从生物活体取下以后,如果不立即进行适当处理,会由于细胞内部各种酶的作用,出现细胞自溶现象。此外,还可能由于污染,微生物在组织内繁殖使细胞的微细结构遭受破坏。因此,为了使细胞结构尽可能保持生前状态,必须做到快、小、准、冷。
(1)动作迅速,组织从活体取下后应在最短时间内(争取在1分钟内) %戊二醛固定液。(2)体积要小,××。也可将组织修成1mm×1mm×2mm大小长条形。因为固定剂的渗透能力较弱,组织块如果太大,块的内部将不能得到良好的固定。
(3)机械损伤要小,解剖器械应锋利,操作宜轻,避免牵拉、挫伤与挤压。
(4)操作最好在低温(0℃~4℃)下进行,以降低酶的活性,防止细胞自溶。
(5)取材部位要准确。
  取材方法:
将取出的组织放在洁净的韧性较大的纸上,滴一滴预冷的固定液,用新的、锋利的刀片成“拉锯式”将组织切下并修小,然后用牙签或镊子将组织块移至盛有冷的固定液的小瓶中。如果组织带有较多的血液和组织液,应先用固定液洗几遍,然后再切成小块固定。
2 固定
 固定的目的
是尽可能使细胞中的各种细胞器以及大分子结构保持生活状态,并且牢固地固定在它们原来所在的位置上。
固定的方法
有物理法和化学法两大类。
物理法系采用冰冻、干燥等手段来保持细胞结构;
化学法是用一定的化学试剂来固定细胞结构。现通常使用化学法对组织或细胞进行固定。
:
(1)四氧化锇(OsO4)
是一种强氧化剂,与氮原子有较强的亲和力,因而对于细胞结构中的蛋白质成分有良好的固定作用。它还能与不饱和脂肪酸反应使脂肪得以固定。此外,四氧化锇还能固定脂蛋白,使生物膜结构的主要成分磷脂蛋白稳定。它还能与变性DNA以及核蛋白反应,但不能固定天然DNA、RNA及糖原。四氧化锇固定剂有强烈的电子染色作用,用它固定的样品图象反差较好。锇固定的时间一般为1-2小时。
(2)戊二醛(  C5H8O2)
戊二醛的优点是对糖原、糖蛋白、微管、内质网和细胞基质等有较好的固定作用,对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强,还能保存某些酶的活力,长时间的固定(几周甚至1~2个月)不会使组织变脆。缺点是不能保存脂肪,没有电子染色作用,对细胞膜的显示较差。  组织块固定常规采用戊二醛—锇酸双重固定法。分前固定和后固定,中间用磷酸缓冲液漂洗。%戊二醛固定2小时以上、后固定用1%锇酸固定液固定1~ 2小时,~。固定完毕,用缓冲液漂洗20分钟后进行脱水。
3 脱水
为了保证包埋介质完全渗入组织内部,必须事先将组织内的水分驱除干净,即用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水,常用的脱水剂是乙醇和丙酮。
急骤的脱水会引起细胞的收缩,因此,脱水应梯度进行: 15% 乙醇15分钟,30%乙醇15分钟,50%乙醇15分钟, 70% 乙醇15分钟,85%乙醇15分钟,95%乙醇15分钟,100%乙醇10分钟(二次)。游离细胞可适当缩短脱水时间。过度脱水不仅引起更多物质的抽提,而且会使样品发脆,造成切片困难。
4 渗透和包埋
    渗透就是利用包埋剂渗入到组织内部取代脱水剂的过程,这种包埋剂在单体状态时(聚合前)为液体,能够渗入组织内,当加入某些催化剂,并经加温后,能聚合成固体,以便进行超薄切片。
目前常用的包埋剂是环氧树脂(epoxy  resin)。环氧树脂是一类高分子聚合物,它的分子中含有两种反应基团,即环氧基和羟基。当加入酸酐类时,树脂分子中的羟基能与酸酐结合,形成分子间的横桥连接,这种起横桥式连接作用的交联剂叫做硬化剂,它们参与交联反应,并被吸收到树脂链中。常用的硬化剂有十二烷基琥珀酸酐(或叫十二碳烯基丁二酸酐,简称DDSA)、甲基内次甲基邻苯二甲酸酐(或叫六甲酸酐,简称MNA)及顺丁烯二酸酐等。