文档介绍：广东药学院
硕士学位论文
氟对大鼠成骨细胞Nrf2-ARE信号转导通路的作用研究
姓名:钟苑芳
申请学位级别:硕士
专业:流行病与卫生统计学
指导教师:余日安
2011-05-10
硕士学位论文氟对大鼠成骨细胞 Nrf2-ARE 信号转导通路的作用研究
氟对大鼠成骨细胞 Nrf2-ARE 信号转导通路的作用研究
硕士研究生:钟苑芳
导师:余日安教授
中文摘要
研究背景及目的
氟是机体必需的微量元素之一,对全身骨骼生长发育和维持骨骼生理结构功能具
有重要作用。但机体摄入过量氟则会引起氟斑牙和氟骨症等骨相损害。近年来,虽然
地方性氟中毒的防治工作已取得很大成就,但地方性氟中毒仍然严重影响着病区人民
的健康。因此,深入揭示氟中毒的发病机制,在地方性氟中毒所致健康损害的防治方
面,具有重要意义。
目前,虽然氟中毒发病的分子生物学机制尚未充分阐明,但氟诱导的氧化应激所
介导的细胞凋亡仍然被认为是慢性氟中毒形成的关键机制之一。氟中毒时可引起机体
发生氧化应激导致体内活性氧簇(Reactive oxygen species, ROS)增高,低浓度的 ROS
作为细胞内反应的信号中间传递体,通过介导体内某些氧化应激敏感性的信号转导途
径而发挥重要作用。近年来,有研究发现核转录因子 NF-E2 相关因子 2(Nuclear factor
E2-related factor 2, Nrf2)和它的胞质接头蛋白(Kelch 1ike ECH associated protein 1,
Keap1)是细胞抗氧化应激的中枢调节者,由此它在抗氧化应激方面所起的作用受到越
来越多的关注。Nrf2 需与其它 bZIP 转录因子形成异源二聚体后再与抗氧化反应元件
(Antioxidant response element, ARE)结合才能够调节和编码抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶
的表达,增加细胞对氧化应激的抵抗作用,维持机体生存。
Nrf2-ARE 通过激活细胞的抗氧化机制及抑制细胞的炎症信号通路,在机体抗氧
化应激方面起着重要的作用。当血红素氧合酶-1( heme oxygenase-1, HO-1)和醌氧化
还原酶 1( NADP(H):quinone oxidoreductase 1 , NQO1)被 Nrf2 诱导表达后,能增强机体
的抗氧化能力。
本研究利用原代培养的大鼠成骨细胞,研究氟对成骨细胞氧化应激,DNA 损伤,
细胞增殖与凋亡, HO-1 和 NQO1 的基因表达及 Nrf2 基因表达和其蛋白含量的影响,
I
硕士学位论文氟对大鼠成骨细胞 Nrf2-ARE 信号转导通路的作用研究
探讨 Nrf2-ARE 信号转导通路在氟致成骨细胞损害中的作用。

方法
1 实验方法
成骨细胞的培养与鉴定
初生(1~2d)SPF 级的 SD 大鼠购自广东省广州中医药大学实验动物中心。无菌
条件下分离大鼠颅盖骨进行成骨细胞的原代培养,细胞常规培养于 DMEM 培养液(含
15%FBS,200∪/ml 双抗),5%CO2、37℃条件下培养。待细胞达到 80%~90%融合时,
以 1:2 进行传代。培养的细胞经形态学观察、NBT/BCIP 法染色鉴定,并绘制细胞的
生长曲线。
成骨细胞形态观察及细胞增殖测定
将成骨细胞接种于 6 孔培养板,观察氟对成骨细胞形态的影响并摄片;将相同数
量的成骨细胞接种于 96 孔板,培养 24h 后,按 NaF 终浓度为、、、、
mmol/L 进行染毒,继续培养 24h、48h 和 72h,用 MTT 法检测细胞的增殖能力。
细胞周期和凋亡率的检测
将细胞接种于 6 孔板培养 24h 后染氟 24h、48h 和 72h,分别收集 12000 个细胞,
用流式细胞仪在激发光波长 Ex=488nm,发射光波长 Em=530nm 下分析 PI 荧光的直方
图。采用美国 PHEONIX 公司的 MULTYCYCLE 软件进行细胞周期的分析,采用
WINMDI 软件进行细胞凋亡率的分析。
成骨细胞氧化应激水平测定
将细胞接种于 24 孔板培养 24h 后染氟 24h、48h 和 72h,收集所得细胞悬液,采
用亚硝酸盐法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,采用二硫双硝基苯甲酸(DTNB)
法测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、采用硫代巴比妥酸(TBA)显色法测
定脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量。
成骨细胞 DNA 损伤的测定
用单细胞凝胶电泳实验(SCGE)检测成骨细胞 DNA 的拖尾及损