文档介绍：核酸的制备及基因组文库的构建
朱德裕
主要内容
、核酸制备的基本原理
核酸制备的基本方法
三、质粒DNA的制备
四、基因组DNA的制备
五、RMA的制备
六、基因组、cDNA文库的构建
、核酸制备的基本原理
DNA主要存于细胞核中,其它如线粒体和质体等,
也含有少量DNA
RNA主要存于细胞质中,其它如线粒体和核仁等也
含有RNA。
在生物体中,DNA和RNA都一般以核蛋白的形式存
核酸不溶于一般有机溶剂。
原核细胞与真核细胞
Eukaryote
DNA
Prokaryote
DNA organized in a single
Nucleus
chromosome
No nucle us No mitosis
DNA organized in multiple
chromosomes inside a nucle us
Mitotic division
类别
原核细胞
真核细胞
细胞大小
较小
无成形的细胞核,有成形的真正的细
细胞核无核膜,无核仁,胞核,有核膜、核
无染色体
仁和染色体
有核糖体
有核糖体、线粒体
等,植物细胞还有
细胞质(唯一的细胞器)叶绿体和液泡等
(有多种细胞器)
生物类群细菌、蓝藻、放线菌植物、动物、真菌
原核细胞简示图
细菌的基本构造
菌毛
细胞质
原核细胞的主要结构有细胞膜
露的DNA双链所构成的拟核。拟
拟核
核没有与细胞质部分相隔开的界
膜(核膜),这是与真核细胞的
荚膜
主要区别
细胞壁
细胞膜
真核细胞中只有植物细胞有细胞
壁
核糖体
鞭毛
原核细胞中的DNA没有组蛋白( histone)与之结合。无有丝分裂( mitosis和减数分裂
( meIosIs,DNA复制后,细胞随即分裂为
真核细胞简示图
真核细胞含有细胞核。
核糖体
DNA与组蛋白等蛋白质
共同组成染色体结构,
相胞枝
浴酶
在核内可看到核仁。真
核生物进行有性繁殖,
并进行有丝分裂。也有
些真核生物的细胞也能
进行无丝分裂,如人的
体肝脏细胞
高尔基体
核酸制备的基本原理
1、细胞破碎
2、将核蛋白解联,即利用解联剂将核蛋白裂
解为核酸和蛋白。
3、精致纯化核酸
注意事项:操作过程应避免核酸的降解,包括
化学因素(如过酸过碱),物理因素(如强烈
振荡、高温、辐射等),生物酶等
、核酸制备的基本方法
(一)细胞破碎
1、物理方法
机械碾碎:对于动物组织(如鼠肝),一般多采用匀
浆的方法。
组织捣碎器:是一种剧烈的破碎的方法,必须保持低温
,时间不宜太长
超声波:借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器的
有效方法。
压榨法:是一种温和、彻底破碎细胞的方法。即用高压
迫使几十毫升细胞悬液通过一个小于细胞直径的小孔,
使细胞被挤压破碎。
2、溶胀和自溶
溶胀:在低渗溶液(如低浓度的稀盐溶液中),由于存在渗透
压差,溶剂分子将大量进入细胞,致使细胞膜膨胀破裂。
自溶:细胞结构在本身所具有的各种水解酶作用下,发生溶
解。应用此法要特别小心,防止目的核酸被分解
3、化学处理
用脂溶性的溶剂(如***、***仿、甲苯等)或表明活性剂
SDS)处理细胞时,可使细胞壁和细胞膜的结构部分溶解,导
致细胞破碎。
生物酶降解
如溶菌酶等生物酶有降解细胞壁的功能。在用此法处理细菌细
胞时,先是细胞壁消融,然后是渗透压引起的细胞膜破裂,导
致细胞破碎
各种组织细胞破碎方法
细胞破碎方法应用
1匀浆法
机体软组织
2捣碎法
动物韧性组织
3研磨法
细菌、酵母
4超声法
细胞混悬液
5反复冻融法
培养细胞
6冷令热交替法
细菌、病毒
高压破碎
细菌、细胞
8有机溶剂细菌、酵母
9去垢剂
组织、培养细胞
10酶解法
田菌、酵母