文档介绍：实验五
动物肝脏中DNA的制备和鉴定
学时：6
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1、掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。
2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。
3、学习核酸染色的方法。
一、实验目的：
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二、实验原理:
要获得纯的DNA样品，必须考虑以下几点：
如何选材，如何破碎组织细胞？
如何除去蛋白质？(在真核细胞内，DNA与蛋白质结合成核蛋白的形式存在。因此，分离DNA时必须使其与蛋白质解离，并除去蛋白质。)
设法除去RNA的污染；
防止DNA酶的降解作用；
（一）动物肝脏DNA制备原理
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选材
要提取动物组织DNA，一般选择细胞膜较脆弱，容易破碎的动物脏器，如胸腺、肝脏、脾脏、胰脏等。
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研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆，破碎细胞。这种方法温和，适合实验室使用。
组织捣碎器：较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热和升温过高，通常是转10秒—20秒，停10秒—20秒，可反复多次。
压榨法：在1000×105Pa—2000×105Pa 的高压下使几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。温和的、彻底破碎细胞的方法，但仪器费用较高。
细胞破碎方法—机械物理法：
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反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。
超声波处理法：借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。使用时注意降温，防止过热。
冷热交替法：在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。
细胞破碎方法—机械物理法
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有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。
细胞破碎方法—化学方法
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(三)除去RNA的方法
脱氧核糖核蛋白在浓NaCl（1-2mol／L）溶液中溶解度很大，／L NaCl溶液中溶解度很低，／L NaCl溶液中，利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核蛋白分离开来。
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(四)除去蛋白质的方法
用氯仿一异成醇混合液振荡核蛋白溶液，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积 95％乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。
用十二烷基硫酸钠（SDS）等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA。
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纯的DNA样品的获得
为了防止DNA酶的降解，提取时可加入适量EDTA（乙二胺四乙酸）、柠檬酸，以降低DNA酶的活性。
加入RNA酶降解剩余的RNA，获得纯的DNA。
保存：将DNA于滤纸上干燥，溶于1mlTE中低温保存。
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