文档介绍：实验五动物肝脏中 DNA 的制备和鉴定学时: 6 1、掌握动物组织总 DNA 的提取方法及其原理。 2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。 3、学****核酸染色的方法。一、实验目的: 二、实验原理: 要获得纯的 DNA 样品,必须考虑以下几点: ?如何选材,如何破碎组织细胞? ?如何除去蛋白质? (在真核细胞内, DNA 与蛋白质结合成核蛋白的形式存在。因此,分离 DNA 时必须使其与蛋白质解离,并除去蛋白质。)?设法除去 RNA 的污染; ?防止 DNA 酶的降解作用; (一)动物肝脏 DNA 制备原理选材要提取动物组织 DNA ,一般选择细胞膜较脆弱,容易破碎的动物脏器,如胸腺、肝脏、脾脏、胰脏等。?研磨: 将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中,加入少量石英砂研磨或匀浆,破碎细胞。这种方法温和,适合实验室使用。?组织捣碎器: 较剧烈的破碎细胞的方法,为了防止发热和升温过高,通常是转 10秒—20秒,停 10秒—20秒,可反复多次。?压榨法: 在1000 ×10 5Pa—2000 ×10 5Pa 的高压下使几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压,细胞将彻底破碎。温和的、彻底破碎细胞的方法,但仪器费用较高。细胞破碎方法—机械物理法: ?反复冻融法: 将待破碎的细胞冷至- 15℃到- 20℃,然后放于室温(或40℃)迅速融化,由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。?超声波处理法: 借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。使用时注意降温,防止过热。?冷热交替法: 在90℃左右维持数分钟,立即放入冰浴中使之冷却,如此反复多次,绝大部分细胞可以被破碎。细胞破碎方法—机械物理法?有机溶剂处理法: 利用***仿、甲苯等脂溶性溶剂或 SDS (十二烷基硫酸钠)等表面活性剂处理细胞, 可将细胞膜溶解,从而使细胞破裂,此法也可以与研磨法联合使用。?溶胀法: 细胞膜为天然的半透膜,在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中,由于存在渗透压差,溶剂分子大量进入细胞,将细胞膜胀破释放出细胞内含物。细胞破碎方法—化学方法(三)除去 RNA 的方法脱氧核糖核蛋白在浓 NaCl (1-2mol /L)溶液中溶解度很大,但在 /L NaCl 溶液中溶解度很低,而核糖核蛋白则溶于 /L NaCl 溶液中, 利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核蛋白分离开来。(四)除去蛋白质的方法?用***仿一异成醇混合液振荡核蛋白溶液,使蛋白质变性,然后离心除去变性蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及***仿相中间,而 DNA 溶于上层水相。用两倍体积 95%乙醇溶液可将DNA 钠盐沉淀出来。?用十二烷基硫酸钠( SDS )等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取 DNA 。纯的 DNA 样品的获得?为了防止 DNA 酶的降解,提取时可加入适量 EDTA (乙二***四乙酸)、柠檬酸,以降低 DNA 酶的活性。?加入 RNA 酶降解剩余的 RNA ,获得纯的 DNA 。?保存:将 DNA 于滤纸上干燥,溶于 1mlTE 中低温保存。